[發明專利]一株解淀粉芽孢桿菌及其菌劑在防治油橄欖果實腐爛病中的應用

有效

• 申請號: 201310494832.9
• 申請日: 2013-10-21
• 公開（公告）號: CN103555617A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 朱天輝;朱涵明月;李姝江;張靜;劉洋;韓珊;譙天敏;張麗娜
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/07
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及生物學領域，尤其涉及的是一株解淀粉芽孢桿菌及其菌劑在防治油橄欖果實腐爛病中的應用。?

背景技術

油橄欖果實腐爛病（Alternaria?tenuissima）是油橄欖產地新發生病害，主要為害果、葉片，造成落果落葉。果實感病后初為黑色小點，逐漸擴大，斑點可聯合成大斑，果實脫落腐爛。目前尚無有效防治方法，特別是無污染防治技術更未涉及。油橄欖果實是橄欖油生產的重要原料，因此，采用無公害環保型措施是防治該病的首選。?

因此，現有技術存在缺陷，需要改進。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術對油橄欖果實腐爛病防治的缺陷，提供了一株解淀粉芽孢桿菌及其菌劑在防治油橄欖果實腐爛病中的應用。?

本發明的技術方案如下：?

一株解淀粉芽孢桿菌，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌，Bacillus?amyloliquefaciens，已于2013年09月12日保藏在中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8177。?

所述的解淀粉芽孢桿菌的菌劑的制作方法，是將營養肉質培養液經高壓滅菌后，在通氧控制下，按100mL液體盛于300mL三角瓶比例裝瓶，在無菌狀態下接種解淀粉芽孢桿菌斜面種子，每瓶接種2支斜面種子，振蕩培養，制成解淀粉芽孢桿菌菌劑。?

所述的菌劑的制作方法，其營養肉質培養液的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL。?

所述的菌劑的制作方法制得菌劑。?

所述的菌劑在預防油橄欖果實腐爛病中的應用，是人工去除病葉、病果后，春季噴灑所述菌劑，每隔10天每株噴200ml，連續三次，可控制病害發生。?

所述的菌劑在預防油橄欖果實腐爛病中的應用，其菌劑濃度為稀釋200倍以下。?

所述的菌劑在治療油橄欖果實腐爛病中的應用，春季噴灑所述菌劑，每隔10天每株噴200ml，連續三次，可顯著治療油橄欖果實腐爛病。?

所述的菌劑在治療油橄欖果實腐爛病中的應用，其菌劑濃度為稀釋100倍以下。?

本發明提供的解淀粉芽孢桿菌Ba4能有效預防和治療油橄欖果實腐爛病。?

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。?

1、內生細菌的分離、純化與保存?

在四川廣元市朝天區核桃根腐病發生地采集健康核桃根系，帶回實驗室分離。采回的樣本用無菌水沖洗干凈，稱取1.0g根組織，用70％的酒精消毒30s，無菌水洗3次后，再用4%的NaClO消毒3min后，無菌水洗3次，吸取最后一次洗滌液100μl涂抹NA平板（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g，蒸餾水1000ml，pH7.0，混勻分裝后121℃高壓滅菌30min），28℃黑暗培養24h，用于表面消毒的對照，檢查表面消毒是否徹底。?

將已表面消毒的根部組織剪碎，放入無菌的研缽，加入滅菌的石英砂和10ml無菌水，充分研磨，靜置30min，稀釋10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5個梯度，分別吸取100μl10^-3，10^-4，10^-5這3個梯度研磨液分別涂布NA平板（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g，蒸餾水1000ml，pH7.0，混勻分裝后121℃高壓滅菌30min），每個處理3次重復，28℃黑暗培養48h，選取生長最為均勻的梯度，進行平板計數。?

依據菌落的大小、顏色、是否突起，邊緣特征、表面光滑與否、透明度等方面的差異，挑取單菌落在NA平板上劃線純化，純化后轉接NA斜面于4℃保藏備用。共獲10個內生細菌。?

2、內生細菌對油橄欖果實腐爛病病菌的平板拮抗作用?

平板對峙法：在培養皿中央接種7d的油橄欖果實腐爛病病菌（Alternaria?tenuissima）菌餅（直徑5mm)，離該病菌餅約3cm處，分別用接種環沾取培養2d的內生菌，在病菌對稱兩側各劃一條細線，28℃培養，以只接種病菌的平板為對照，待對照長滿皿時測量病菌的菌落生長直徑，每處理重復3次。按下式計算菌落生長抑制率：?