[發明專利]一種Δ12-脂肪酸脫氫酶基因及其重組表達載體

有效

• 申請號: 201310493995.5
• 申請日: 2013-10-21
• 公開（公告）號: CN103525841A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 張琦;胡彬彬;何仕武;魏云林;林連兵;季秀玲
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10
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技術領域

本發明屬于生物技術領域和遺傳工程領域，涉及一種Δ¹²-脂肪酸脫氫酶基因及其重組表達載體，具體涉及從酵母---黏紅酵母（Rhodotorula?glutinis）YM25079中克隆的Δ¹²-脂肪酸脫氫酶基因及將該基因直接與不同載體連接，轉入細菌、酵母、植物或動物中，利用其編碼Δ¹²-脂肪酸脫氫酶產生不飽和脂肪酸。

背景技術

Δ¹²-脂肪酸脫氫酶(Δ¹²-fatty?acid?desaturases)又稱油酸脫氫酶(oleate?desaturases)。Δ¹²-脂肪酸脫氫酶屬于一類膜整合酶，由于分離和鑒定膜結合蛋白的難度很大[MaKeon，1981，酶學方法，12141-12147；wang等，1988，植物生理學生物化學，26:777-792]，因此很難得到包括Δ¹²-脂肪酸脫氫酶在內的各種膜結合蛋白性質脫氫酶高級機構，而只能通過對酶的核苷酸序列進行初步研究，或者在異源的受體內表達來研究酶的底物特異性。序列對比的結果表明，編碼Δ¹²-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列具有共同的機構特性：存在三個組氨酸保守區，形成四次跨膜的結構[Kyte?et?al，1982，J.Mol.Biol.157:105-132]，這些都是維持脫氫酶所必須的。

Δ¹²-脂肪酸脫氫酶的主要作用是在單不飽和脂肪酸油酸(oleic?acid)的第12和13位碳原子之間插入一個雙鍵，形成含有2個雙鍵的多不飽和脂肪酸-亞油酸(linoleic?acid)。Δ¹²-脂肪酸脫氫酶是油酸脫氫形成亞油酸的關鍵酶，是多不飽和脂肪酸(polyunsaturated?fatty?acid)代謝ω-3、ω-6途徑的限速酶，控制著植物細胞中大多數不飽和脂肪的合成，只存在于植物和微生物中，人和哺乳動物細胞中缺乏在脂肪酸的第9位碳原子以上位置引入不飽和雙鍵的脫氫酶，這些多不飽和脂肪酸必須從食物中獲取。因此，亞油酸和α-亞油酸是人體必須脂肪酸，膳食性攝入亞油酸和α-亞油酸，經Δ6-脂肪酸脫氫酶催化轉化成γ-亞油酸和十八碳四烯酸，它們又在其它相關酶的催化下可進一步轉化成其它長鏈多不飽和脂肪酸[Horrobin?DF，1992，Prog?Lipid?Res，31:163-194]。這些長鏈多不飽和脂肪酸是有機體組織生物膜組成成分，起到維持細胞正常功能和增加機體抗逆性的作用[Napier?JA?et?al，1999，Curr.Opin.Plant?Biol，2:123-127]，因此包括亞油酸在內的多不飽和脂肪酸在保健和醫療方面有很廣闊的應用前景。研究不飽和脂肪酸的合成和它的生理作用成為當前的熱點。

對于脂肪酸脫氫酶的生物學功能，許多實驗室采用了從各種生物體中克隆相關的基因并轉入各種受體中，在受體中觀察受體的脂肪酸改變的方法。目前，已從動物、植物、微生物等不同來源中分離到許多Δ¹²-脂肪酸脫氫酶基因的同源序列，并且證明具有相應的生物學功能。尤其是近幾年來隨著雙功能Δ¹²-脂肪酸脫氫酶的發現[Edgra?B.?Cahoon?et?al，2001，THE?JOURNAL?OF?BIOLIGICAL?CHEMISTRY，26：2637-2643.]和共軛油酸在醫療保健功能的發掘，人們越來越認識到不飽和脂肪酸的重要性，并且常規的生物化學方法很難分離純化膜結合的Δ¹²-脂肪酸脫氫酶，研究其在自然環境中的生化特性比較困難，因此人們的注意力又開始轉向對Δ¹²-脂肪酸脫氫酶的研究上。

目前，不飽和脂肪酸主要來源于動物、植物和低等生物等，與動植、物油生產PUFAs相比，微生物油脂的生產有很多優點，如生產周期短、微生物方法生產不受場地、氣候、季節的影響及利用不同的菌種和培養基適合開發功能油脂等。目前分離到的脫氫酶和延伸酶效率較低且大多數對脂肪酸底物鏈長、雙鍵數目及雙鍵位置不具有嚴格的專一性，除目標產物外，還會生產一些非特異脂肪酸。由于這些脂肪酸的作用還不清楚，所以它們的出現不利于轉基因植物的商業化應用，因此需要繼續篩選具有高的底物特異性的脫氫酶和延伸酶。應用基因工程技術構建特異性生產多不飽和脂肪酸的轉基因油料植物，直接改善油脂品質，更加具有實際應用價值。本研究通過多種手段發掘多不飽和脂肪酸合成的高效、特異性新基因，為新一代轉基因脂肪酸產品的品質改良奠定基礎。

發明內容