[發(fā)明專利]一種防治擬松材線蟲病的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310493103.1
• 申請日: 2013-10-21
• 公開（公告）號: CN103493811A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱天輝;朱涵明月;李姝江;張靜;韓珊;譙天敏;張麗娜
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01N43/22
• 分類號: A01N43/22;A01P1/00;A01G13/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種防治擬松材線蟲病的方法。

背景技術(shù)

近年來在我國的許多非松材線蟲疫區(qū)（重慶南山、福建邵武、四川等）的馬尾松發(fā)生大面積死亡，但是死樹中沒有發(fā)現(xiàn)松材線蟲(Bursaphelenchus?xylophilus)，而是大量擬松材線蟲（Bursaphelenchus?mucronatus），確認了擬松材線蟲對松樹具有致病性，但它的致病機理目前還尚未有研究，其防治方法借簽松材線蟲病。

研究表明體表消毒后的擬松材線蟲單獨致病性很弱，而擬松材線蟲體表有大量附生微生物，這些微生物對馬尾松的致病作用，特別是擬松材線蟲體表攜帶的杓蘭果膠桿菌產(chǎn)生非蛋白液對馬尾松有強烈致病作用，杓蘭果膠桿菌和線蟲的共生是擬松材線蟲致病的必要因素，也是杓蘭果膠桿菌保持活力的必要條件。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種防治擬松材線蟲病的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種防治擬松材線蟲病的方法，是采用注射法將羅紅霉素注入松樹，每年春、秋各一次。

所述的方法，羅紅霉素濃度為50-100μg/ml。

所述的方法，在松樹1.3m高處注射羅紅霉素。

所述的方法，羅紅霉素注入深度達松樹木質(zhì)部。

所述的方法，每株松樹注入羅紅霉素100mL。

所述的方法，在松樹的東、南、西、北方向各注射25ml羅紅霉素。

本發(fā)明對擬松材線蟲病的防治效果顯著。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。

1、擬松材線蟲的獲得與培養(yǎng)

取某地云南松瀕臨枯死樣木，利用貝爾曼漏斗分離法，分離得到線蟲，運用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進行鑒定。將線蟲接入生長有擬盤多毛孢（Pestalotiopsis?heterocornis）的培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，待該菌被吃光后，線蟲置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、線蟲體表可培養(yǎng)微生物的分離、純化

對1中所得擬松材線蟲進行體表微生物的分離。線蟲用滴管吸1滴于玻片上，在顯微鏡下用移液器吸取單條線蟲，將5-10條線蟲置于凹玻片中用3%過氧化氫消毒1min（除去腐生菌），在顯微鏡下將線蟲用滅菌的去離子水清洗3次后用移液槍接于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)。細菌菌落出現(xiàn)，用平板劃線分離法純化細菌。將純化的細菌移至NA（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g，蒸餾水1000ml，pH7.0，混勻分裝后121℃高壓滅菌30min）斜面上于4℃保存。真菌菌落出現(xiàn)時，挑取不同的菌落轉(zhuǎn)接于PDA（土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，混勻分裝后121℃高壓滅菌30min）平板純化。將純化的真菌移至PDA斜面上于4℃保存。

3、細菌16S?RNA分類鑒定

3.1DNA提取

利用TIANamp?Bacteria?DNA?Kit細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。提取的DNA用1.5mLEP管置于-20℃保存。

3.2PCR反應(yīng)

選取細菌通用引物1和2，引物1：5'-AGA?GTT?TGA?TCC?TGG?CTC?AG-3'，引物2：5'-GGT?TAC?CTT?GTT?ACG?ACTT-3'，總PCR反應(yīng)體系共50μL，其中模板6μL，引物4μL，2×TCP?PCR?master?mix25μL，去離子水15μL。設(shè)空白對照。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃1min，72℃2min，30個循環(huán)，72℃延伸10min。

3.3電泳檢測

取PCR產(chǎn)物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，180V，1h。凝膠成像系統(tǒng)觀察照相，檢測PCR產(chǎn)物大小。

3.4測序鑒定

將PCR產(chǎn)物直接送于天根生物檢測公司，進行純化，雙向測序。將所得序列通過與NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對，構(gòu)建遺傳樹，鑒定細菌。

4、真菌ITS序列分析鑒定

4.1DNA提取

菌絲長滿平板后，用TIANamp?Plant?DNA?Kit植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。DNA置于-20℃保存。

4.2PCR反應(yīng)