[發明專利]一種區分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對、試劑盒以及PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201310491645.5
• 申請日: 2013-10-21
• 公開（公告）號: CN103540664A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 張翔;湯寶珍;侯有明;黃斌
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

本發明涉及昆蟲領域，尤其涉及一種區分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對、試劑盒以及PCR檢測方法。

背景技術

水椰八角鐵甲與椰心葉甲兩種害蟲均能嚴重危害棕櫚科植物，使得近年來棕櫚科植物遭受嚴重侵害，造成了上億元的經濟損失。

水椰八角鐵甲為鞘翅目，鐵甲科害蟲，主要隨苗木運輸傳播，原產地為馬來西亞，在2001年在中國海南省發現，水椰八角鐵甲取食植株的嫩梢、幼莖和未完全展開的幼葉，使葉片呈現褐色或灰褐色條斑、皺縮、卷曲等，受害嫩梢逐漸枯萎死亡，嚴重時整株枯死，可嚴重危害椰子、西密棕、加拿利海棗等棕櫚科植物，是一種危險的有害入侵生物。

椰心葉甲是一種重大危險性外來有害生物，屬毀滅性害蟲，它在寄主上的危害部位為最幼嫩的心葉，葉片受害后出現枯死被害狀，嚴重時植株死亡。具有繁殖快、破壞性強和防治難度大的特點。國家禁止進境的國際二類植物檢疫對象，危害以椰子為主的棕擱科植物。椰心葉甲的入侵和造成的嚴重危害，已給海南省獨特的森林經濟資源造成了巨大的破壞，并對海南省自然生態環境構成了嚴重的威脅。從而引發了全社會的積極關注和廣泛重視。堅決遏制疫情擴大蔓延的兇猛趨勢，盡快實現持續防控的目標，是當前一項十分重要而緊迫的工作任務。

因此，對水椰八角鐵甲與椰心葉甲的研究具有重要意義，預防它們的傳播是對其有效的防控方法之一。但是，水椰八角鐵甲與椰心葉甲具有許多相同的寄主以及生活習性，外形特征存在很多相似點，難以區分，尤其在進口檢疫和害蟲普查時，準確區分兩種害蟲，采取相應的檢疫措施和應急處理極為重要，所以要對其進行正確及時的預防和控制，最首要的工作就是準確的區分二者。

現有利用PCR-RFLP方法，通過線粒體細胞色素氧化酶I基因（COI），快速區分椰心葉甲的兩個亞種，以及用水椰八角鐵甲和椰心葉甲成蟲體形大小的觀察、比較，這些方法均未涉及水椰八角鐵甲和椰心葉甲種間精確的區分，而傳統的分類學方法專業性太強，且要求以成蟲區分，從幼蟲，為害狀上較難區分，要求蟲體結構完整，各個部位特征發育完全，在蟲體破壞和腐敗情況下，難以進行鑒別，易出錯。

發明內容

本發明的目的在于提供一種區分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的特異引物對、試劑盒以及PCR檢測方法，這種方法能夠快速準確的區分這兩種昆蟲。

為實現上述目的，本發明采用以下的技術方案：?

一種PCR檢測方法快速區分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對，采用水椰八角鐵甲的COI基因片段設計的特異引物對，所述特異引物對為：

上游：5′-CTTGAGCTGTTATATCACCG-3′，

下游：5′-TTCATAAAGTAAAGGAGTCCG-3′。

所述特異引物對存放于試劑盒中，所述試劑盒包含，

TaqDNA?聚合酶5u/μl，10×PCR緩沖液，25?mM?MgC_l2，2?mM?dNTPs，滅菌雙蒸水，10?μΜCOI特異引物對。

采用權利要求1所述引物對和權利要求2?所述試劑盒快速區分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測方法，所述PCR檢測方法包括以下步驟：

1）提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板；

2）DNA模板的完整性檢測，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用COI通用引物對和權利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進行擴增，用于檢驗水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性；

3）將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述COI特異引物對和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進行擴增；

4）將步驟2）和步驟3）得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的COI片段，在電泳儀上進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統采集電泳圖，觀察電泳條帶發現，水椰八角鐵甲和椰心葉甲在COI通用引物反應下，都出現條帶，與COI特異引物反應下，只有水椰八角鐵甲出現條帶，其位置在750~850bp，其為SEQ?ID?No.9所示的COI序列，而椰心葉甲沒出現條帶，說明該引物對水椰八角鐵甲具有特異性，從而可以區分兩個物種。

所述步驟2）和步驟3）中，PCR反應體系中，PCR反應程序為：