[發明專利]富勒烯及其衍生物在多重PCR檢測中的應用

有效

• 申請號: 201310490097.4
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN103589788A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 張勝楠;楊乃波;郭蘭英;王婉真;王素紅;王怡禛
• 申請（專利權）人: 華美生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70;C12Q1/10
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 田小伍

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，具體涉及富勒烯及其衍生物在多重PCR檢測中的應用。

背景技術

多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、反應試劑、反應時間和操作過程與一般PCR相同。

與常規PCR檢測技術相比，多重PCR檢測法在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨特的優勢和很高的實用價值，適用于臨床檢測、衛生防疫及流行病學調查等。多重PCR在同一體系中加入多種引物，并對多個待檢基因進行擴增，檢測多種病原體只需一次PCR反應，因此在鑒別診斷混合感染時更加方便、快捷和高效。然而，當同一反應體系內涉及多個靶標和引物對時，隨著引物數量的增加，錯誤引發擴增和引物相互干擾的機率大大增加，表現為多重PCR反應體系內多個分子靶點擴增不兼容、擴增背景過高、可重復性差等問題，其中多個靶點擴增條件不兼容對多重擴增的影響最大。因為每個靶點都需要兩邊的引物配合，其默契配合的難度猶如要求所有的田徑選手在跑道上同時起跑又同時到達一樣。用Tm值評價，單靶點反應的成功率在85%左右，每增加一個靶點，其成功率就要在0.85的基礎上增加一個指數值，如同時擴增2個靶點，其成功率為0.85²=72.25%，而同時能成功擴增5個靶點的幾率為0.85⁵=44.37%。這就意味著多重PCR靶點越多，成功的幾率就越小，可重復性也越差。

而在實踐中，需要同時鑒定的靶點往往較多。比如在人肺部感染的鑒別診斷中，可能病原體包括病毒、細菌、支原體、衣原體、真菌等至少幾十種，還不包括和考慮型以下的區分。可見，現有多重PCR檢測技術尚不能完全滿足現實需求，兩者間仍存在很大矛盾亟待解決。

發明內容

本發明的是為了提供一種將富勒烯或其衍生物添加到多重PCR擴增體系中，以平衡擴增速率、提高檢測靈敏度和可重復性。

基于上述目的，本發明采取了如下技術方案：

富勒烯及其衍生物在多重PCR檢測中的應用。

所述應用的具體步驟為：將富勒烯和/或其衍生物添加到多重PCR擴增體系中，同時擴增多個特定基因，并對擴增產物進行檢測（比如實時熒光定量PCR檢測儀）。

所述富勒烯和/或其衍生物在多重PCR擴增體系中的添加濃度為0.01mM～0.09mM/L。

所述添加濃度為0.01mM～0.03mM/L。

所述富勒烯為C₆₀。

所述富勒烯衍生物為富勒醇。

所述富勒醇為C₆₀（OH）_20-24。

目前，雖然有文獻記載富勒烯對PCR反應具有抑制作用，但這些文獻的研究重點主要集中在富勒烯及其他納米材料的生態風險評估上，并未給出富勒烯及其衍生物在PCR檢測領域的應用價值。本發明通過大量實驗發現，在多重PCR反應中，富勒烯（衍生物）對PCR反應的抑制作用與反應的擴增速率成正比，即：擴增反應越快，抑制越強。因此，建立和優化多重PCR擴增體系后，在體系中加入一定量的富勒烯（衍生物），能夠降低活性過高引物對的擴增速率，使多個靶點的擴增條件趨于同步，以克服反應體系內擴增背景過高、可重復性差等缺陷，提高PCR檢測的靈敏度和檢測效率。

同時，本發明提供的方法操作簡單，對現有多重PCR檢測的步驟影響很小，易于推廣應用。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明做進一步說明。

實施例1：多種PCR實驗中富勒烯濃度的選擇和效果證實

在已優化的細菌性肺炎、細菌性腸胃炎、流感等三種多重PCR體系中分別加入富勒烯衍生物C₆₀（OH）₂₂，其濃度梯度依次為0.10mM、0.09mM、0.06mM、0.03mM、0.01mM、0.005mM、0.001mM，按照50℃反應15min，然后95℃保溫10min；再按95℃，8s→60℃，34s，循環40次的條件進行PCR分析。以未加入C₆₀（OH）₂₂的反應體系為對照，三種體系試驗后的熒光曲線均呈現相同特征，試驗結果見表1：

表1