[發明專利]一種提高微生物終細胞密度并縮短培養時間的方法

在審

• 申請號: 201310489634.3
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN104561139A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 丁家海;稱素鴻;馮小華;黃興東
• 申請（專利權）人: 中國石油化工股份有限公司;中國石化揚子石油化工有限公司
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李慧惠;楊思捷

1.?一種提高微生物終細胞密度并縮短培養時間的方法，所述方法包括有氧培養菌體，所述有氧培養菌體包括一級和二級種子培養，其中一級種子培養的補糖方式為指數補料，二級種子培養的補糖方式為恒定補料。

2.?一種縮短微生物厭氧發酵生產過程的時間的方法，所述方法包括在厭氧發酵前進行有氧培養菌體，所述有氧培養菌體包括一級和二級種子培養，其中一級種子培養的補糖方式為指數補料，二級種子培養的補糖方式優選為恒定補料。

3.?根據權利要求1或2的方法，其中所述指數補料是指通過調節葡萄糖的補加速率控制細胞比生長速率在0.1~0.2h^-1。

4.?根據權利要求1或2的方法，其中所述恒速補料是指以恒定的葡萄糖補加速率使得原料葡萄糖成為限制性生長因素，并使得細胞比生長速率在0.03~0.07h^-1。

5.?根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述產物選自丁二酸。

6.?根據權利要求5的方法，其中所述微生物選自大腸桿菌。

7.?根據權利要求6的方法，其中所述微生物為重組大腸桿菌。

8.?根據權利要求1-7中任一項的方法，其中補充的糖類選自葡萄糖。

9.?根據權利要求1-8中任一項方法，其中在一級種子培養中溶氧維持在20%以上。

10.?一種延長丁二酸菌株對數生長期減少種子液培養級數的方法，包括以下步驟：

（1）種子液活化：從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養基，在37℃，200?r/min條件下搖瓶培養6~8?h，至菌體密度（OD600）值在3~5之間；

（2）一級種子液制備：按接種量5~10%轉接JSM一級種子培養基，添加葡萄糖至初始濃度為5~10?g·L^-1，待菌株度過延滯期且葡萄糖消耗至低于0.5~1?g·L^-1后，葡萄糖開始指數補料，且培養過程通過提高轉數及通氣量使溶氧維持在20%以上；

（3）二級種子液制備：按1~2%轉接JSM二級種子培養基，添加葡萄糖至初始濃度為25~30?g·L^-1，待菌株度過延滯期且葡萄糖消耗至低于0.5~1?g·L^-1后，葡萄糖開始按2~3g·?L^-1·h^-1恒速補料，維持細胞OD值每小時增加2~3，當OD值提高速度下降致<1時，轉厭氧發酵；

（4）發酵產丁二酸過程：將二級種子液全部移種至厭氧發酵罐中，以0.1~0.2?vvm的通氣流量連續通二氧化碳氣體維持發酵罐中厭氧環境，并以碳酸鈉作為酸中和劑控制pH值在6.4以上，控制溫度在35~40℃，轉化葡萄糖合成丁二酸。