[發明專利]番茄SlEBI基因及其RNAi表達載體和應用

有效

• 申請號: 201310488886.4
• 申請日: 2013-10-17
• 公開（公告）號: CN103525828A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 胡宗利;董婷婷;陳國平;朱明庫;張建苓;殷文成
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;A01H5/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及番茄SlEBI基因和利用該基因構建的RNAi載體及其應用，還涉及該RNAi載體的構建方法。

背景技術

番茄是一種深受人們所喜愛的世界性蔬菜。其每一臺花序一般8到12朵花，且由于每一花柄處都具有離區，使得花朵在受到外力（如風、雨等）影響時極易脫落，這一特征大大限制了番茄的產量。而番茄的產量是農民們一直關注的重要問題。傳統的育種方法一般通過雜交等方法增加番茄重量或延長番茄結果期來培育高產品種。該方法周期長、耗資多、增產效果并不理想且不可穩定遺傳。目前，傳統育種方法已不能滿足番茄生產的需要。近年來，隨著基因工程的迅速發展和轉基因技術的日益完善，基因工程技術在培育高產番茄方面顯示了極大的潛力。自1983年世界上第一例轉基因作物問世以來，轉基因植物的研究得到了迅速發展。1994年延熟保鮮轉基因番茄在美國批準上市。目前，基因工程技術已廣泛的用于番茄品種的改良和育種中。利用基因工程技術快速獲得穩定遺傳的番茄新品種必將是當前和未來的發展趨勢。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種番茄SlEBI基因；本發明的目的之二在于提供番茄SlEBI基因核心片段；本發明的目的之三在于提供番茄SlEBI基因核心片段在培育多花高產番茄品種中的應用；本發明的目的之四在于提供番茄SlEBI基因核心片段在培育花柄無離區番茄品種中的應用；本發明的目的之五在于提供含有SlEBI基因核心片段的RNAi表達載體；本發明的目的之六在于提供含有所述RNAi表達載體的微生物轉化體；本發明的目的之七在于提供RNAi表達載體的制備方法；本發明目的之八在于提供RNAi表達載體在培育多花高產番茄品種中的應用。

1,番茄SlEBI基因，核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

2.番茄SlEBI基因核心片段，核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示。

3.所述番茄SlEBI基因核心片段在培育多花高產番茄品種中的應用。

4.所述番茄SlEBI基因核心片段在培育花柄無離區番茄品種中的應用。

5.含有所述SlEBI基因核心片段的RNAi表達載體。

優選的，所述RNAi表達載體是以pBin19載體為骨架載體，在多克隆酶切位點處插入順序連接的CaMV35S啟動子、番茄SlEBI基因核心片段的反向序列、PDK內含子、番茄SlEBI基因核心片段正向序列和Nos終止子表達框。

6.含有所述RNAi表達載體的微生物轉化體。

7.所述RNAi表達載體的制備方法，包括如下步驟：

a.以含SEQ?ID?No.6的重組質粒為模板，以SEQ?ID?No.4和SEQ?ID?No.5為引物進行PCR擴增，將擴增產物純化后用Cla?I和Xba?I雙酶切，再與經同樣雙酶切的pHANNIBAL載體連接，獲得重組質粒pHANNIBAL::SlEBI(1)；

b.按步驟a的方法進行PCR擴增，將擴增產物純化后用Kpn?I和Xho?I雙酶切，再與經同樣雙酶切的重組質粒pHANNIBAL::SlEBI(1)連接，獲得重組質粒pHANNIBAL::SlEBI(2)；

c.將步驟b所得重組質粒pHANNIBAL::SlEBI(2)用Sac?I和Spe?I雙酶切，再與經Sac?I和Xba?I雙酶切的pBin19載體連接，得RNAi表達載體。

優選的，所述含SEQ?ID?No.6的重組質粒由如下方法制備，以含SlEBI基因的重組質粒為模板，以SEQ?ID?No.4和SEQ?ID?No.5為引物進行擴增，將擴增產物與pGEM-T?Easy載體連接，得含SEQ?ID?No.6的重組質粒。

8.所述RNAi表達載體在培育多花高產番茄品種中的應用。

本發明的有益效果在于：本發明獲得了番茄SlEBI基因，利用番茄SlEBI基因核心片段構建番茄SlEBI基因沉默的RNAi載體，將該RNAi載體轉入番茄，所得轉基因番茄陽性植株中SlEBI基因的表達均較非轉基因植株顯著降低，植物株型為多花及花柄無離區表型，成功獲得了多花且不易落花落果的高產番茄新品種；與傳統育種方法通過雜交等方法培育高產品種的周期長、耗資多、增產效果不理想且不可穩定遺傳相比，本發明采用基因工程技術，高效并可穩定遺傳地增加了番茄的花數，進而增加了產量，為番茄的品種改良作出了積極的探索，也為觀賞植物的多花育種和其他植物的高產育種提供了參考和借鑒，所得多花高產番茄新品種具有良好的市場前景和經濟價值。