[發(fā)明專利]一種基于DCDR光譜技術(shù)的精漿果糖快速檢測(cè)的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310488274.5
• 申請(qǐng)日: 2013-10-18
• 公開（公告）號(hào): CN103529013A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃祖芳;陳榮;李永增;郭利斌;林金勇;陳希文;王靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/65
• 分類號(hào): G01N21/65;G01N1/40
• 代理公司: 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及一種基于液滴沉積拉曼光譜（DCDR）技術(shù)快速檢測(cè)精漿中果糖含量的方法，具體說就是，通過精漿樣品的過濾處理及液滴沉積實(shí)現(xiàn)果糖的局部富集，然后通過其特征譜峰的測(cè)量，結(jié)合光譜強(qiáng)度比值法獲得精漿果糖含量的快速測(cè)量。?

背景技術(shù)

精漿果糖是男性附性腺精囊所分泌的特征性物質(zhì)，是精子在精液中主要的糖類能源，直接參與精子的獲能和受精過程。當(dāng)精囊腺功能紊亂時(shí)，精液內(nèi)果糖含量也降低，低果糖容易引起精子活力不足，導(dǎo)致不育。因而精漿果糖的測(cè)定對(duì)判斷男性生育能力具有重要意義。2003年李德忠等對(duì)76例不育患者和32例生育者精漿果糖濃度測(cè)量發(fā)現(xiàn)，不同精子密度不育癥患者中，精漿果糖含量有明顯差異。Buchet?WM等研究發(fā)現(xiàn)，非阻塞性無精子癥患者精漿果糖濃度高于正常生育組，提示可能是無精子癥時(shí)精子對(duì)果糖的利用減少，或精囊分泌果糖的量增加所致。此外，精漿中的果糖含量，還可作為鑒別無精子癥病因的主要依據(jù)，無精子癥患者精液中有果糖，說明阻塞是在精囊以上，屬單純輸精管阻塞，不影響精囊中果糖的正常排出；如果精液中無果糖，則可說明患者存在著精囊和輸精管的不發(fā)育或缺如。最后，果糖含量還間接的反映睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的功能，雄性激素不足可造成果糖含量降低。目前臨床針對(duì)精漿果糖含量的測(cè)量主要為吲哚法。缺點(diǎn)是：依賴檢測(cè)試劑盒，需在濃鹽酸環(huán)境下反應(yīng)，由于濃鹽酸易揮發(fā)，易造成反應(yīng)重復(fù)性差，且標(biāo)本檢測(cè)量大時(shí)，操作時(shí)間的延長(zhǎng)，影響更為明顯。同時(shí)，強(qiáng)酸還易污染腐蝕儀器。此外，試劑盒檢測(cè)存在操作步驟繁瑣，耗時(shí)，不適合臨床開展大范圍的應(yīng)用。

因此，如何實(shí)現(xiàn)精漿中果糖含量的簡(jiǎn)便、低成本、快速檢測(cè)，是目前急需解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于就現(xiàn)有精漿中果糖含量測(cè)量方法存在樣品處理步驟繁瑣、操作復(fù)雜、需較多耗材的情況下，提供一種操作簡(jiǎn)便、快速、成本低、易于普及推廣的精漿中果糖含量定量檢測(cè)的方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的采用的技術(shù)方案是：

1、精漿超濾液制備

液化后的精液樣品，離心機(jī)上以3000g離心力離心10分鐘，移液槍吸取上層精漿溶液1～3ml，緩慢注入到Amicon?ultra-4離心管中（截止蛋白分子量為3kDa），然后在eppendorf離心機(jī)上以7500g離心力離心10-18分鐘，獲得精漿超濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

2、精漿超濾液的液滴沉積處理

為實(shí)現(xiàn)精漿超濾液中果糖的局部富集，吸取10μl的精漿超濾液滴加于光滑、干燥的Ramchip基底（Z&S?tech,?USA）中，而后放入恒溫干燥箱進(jìn)行加熱干燥，干燥溫度為28～30℃，干燥時(shí)間為12～16分鐘，最終形成精漿超濾液的液滴沉積。

3、拉曼光譜測(cè)量

采用Renishaw?Invia顯微拉曼光譜系統(tǒng)，將形成的精漿超濾液的液滴沉積置于顯微鏡下，采用20倍物鏡（N.A.=0.4,?Leica）聚焦，設(shè)置CCD曝光時(shí)間為22～26s，400～1800cm^-1波數(shù)范圍，采集拉曼光譜信號(hào)。重復(fù)測(cè)量三次，取其平均值。

4、果糖為內(nèi)標(biāo)的DCDR定量檢測(cè)

（1）用移液槍吸取保存?zhèn)溆玫木珴{超濾液，分成A、B兩等份，其中A中加入等體積量濃度為20mg/ml的果糖溶液，并吸取10μl滴加到Ramchip基底形成液滴沉積；從B中吸取10μl也滴加到Ramchip基底形成液滴沉積；分別測(cè)量液滴沉積中心位置400～1800cm^-1波數(shù)范圍的拉曼光譜，記錄并比較兩者在627cm^-1峰位的光譜強(qiáng)度值，確定627cm^-1為果糖的重要特征峰，其強(qiáng)度值可客觀反映果糖含量的改變。

（2）吸取10μl的精漿超濾液和購(gòu)買的粉末狀標(biāo)準(zhǔn)樣果糖配制成已知濃度為10mg/ml的果糖溶液分別靜置于光滑、干燥的Ramchip基底。利用恒溫干燥箱下進(jìn)行加熱干燥12～16分鐘，完成液滴沉積。測(cè)量并記錄精漿超濾液的果糖特征峰627cm^-1的強(qiáng)度值，同時(shí)以已知濃度（10mg/ml）的果糖溶液為參考，通過特征峰的強(qiáng)度比值計(jì)算出超濾液中果糖的濃度含量。

本發(fā)明與對(duì)應(yīng)樣品的精漿果糖試劑盒定量檢測(cè)結(jié)果與DCDR方法檢測(cè)的果糖濃度值進(jìn)行比較，樣品處理步驟簡(jiǎn)單，幾乎無需實(shí)驗(yàn)耗材，可快速（35分鐘內(nèi)）檢測(cè)，易于普及推廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中精漿超濾液液滴沉積分布透射圖。

圖2是本發(fā)明中精漿超濾液和混有果糖的精漿超濾液DCDR光譜比較圖。