[發(fā)明專利]多級PCR檢測淋病奈瑟菌的方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310487967.2
• 申請日: 2013-10-17
• 公開（公告）號: CN103882101B
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發(fā)明（設計）人: 洪國藩
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/04;C12M1/34;C12R1/36
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;劉真真

1.一種非診斷且非治療性的鑒別病原體種類或型別的方法，其特征在于，包括步驟：

(a)在封閉的第一級PCR反應腔或隔室中，以含有或可能含有病原體核酸的樣本為模板，通過所述病原體特異性的第一引物對進行擴增，從而獲得第一擴增產物P1；

(b)將第一擴增產物從第一級PCR隔室轉移至第二級PCR隔室中，作為第二級PCR的模板，并在封閉的第二級PCR隔室中，通過所述病原體特異性的第二引物對進行擴增，從而獲得第二擴增產物P2；

(c)任選地，將上一步驟的擴增產物Pi從第i級PCR隔室轉移至第i+1級PCR隔室中，作為第i+1級PCR的模板，并在封閉的第i+1級PCR隔室中，通過所述病原體特異性的第i+1引物對進行擴增，從而獲得第i+1擴增產物P_i+1，其中i為≥2的正整數(shù)；本步驟可進行一次或多次；

(d)對前述步驟中獲得的所述第二擴增產物P2或所述第i+1擴增產物P_i+1，進行測序，從而獲得擴增產物的序列；和

(e)將測得的擴增產物序列與病原體標準序列進行比對，從而鑒別出病原體的種類或型別；

并且，所述病原體為細菌；

且在步驟(a)中，第一級PCR隔室中放置有可攜帶PCR擴增產物的固體顆粒，從而在PCR反應過程中或之后，形成攜帶PCR擴增產物的固體顆粒；且所述的固體顆粒是磁性微球；且在步驟(b)和(c)中，利用磁鐵或電磁鐵，通過所述攜帶PCR擴增產物的固體顆粒，將第j擴增產物P_j從第j級PCR隔室轉移至第j+1級PCR隔室，其中j為≥1的正整數(shù)；

其中，該過程在多級PCR反應管中進行，所述反應管由二個或多個可封閉的PCR反應腔或隔室(10)，以及在至少兩個隔室之間設有的封閉的或可封閉的連接通道(40)所組成，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒(50)從一個隔室或上游隔室轉移至另一隔室或下游隔室；

且所述的隔室具有腔蓋，并且對于相互連通的多個隔室而言，當各自的腔蓋全部蓋上后，就構成一個封閉空間，并且所述腔蓋為密封蓋；且在多級PCR反應開始至多級PCR反應結束期間，整個所述的多級PCR反應管處于完全封閉狀態(tài)。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)和(c)中，將第j擴增產物P_j從第j級PCR隔室轉移至第j+1級PCR隔室過程中，第j級PCR隔室和第j+1級PCR隔室都處于封閉狀態(tài)，其中j為≥1的正整數(shù)，并且在第j級PCR隔室和第j+1級PCR隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從P_j級隔室或上游隔室轉移至P_j+1級隔室或下游隔室。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)、(b)和(c)的整個過程中，所有的PCR隔室都處于封閉狀態(tài)。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的病原體為奈瑟菌科(Neisseriaceae)細菌。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的第一引物對為C trachomatis HiFi外側引物對即HiFi DNA Tech No.4003。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的第二引物對為C trachomatis HiFi外側引物對即HiFi DNA Tech No.4004；且當i＝2時，第三引物對與第二引物對相同。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原體為奈瑟菌屬(Neisseria)細菌。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原體為淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)。