[發(fā)明專利]一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310487581.1
• 申請日: 2013-10-17
• 公開（公告）號: CN103540661A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李錦蓮;武冬梅;藺潤先;劉繼光;王景濤;朱金玲;高廣剛
• 申請（專利權(quán)）人: 佳木斯大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/26
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 侯靜

1.一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測方法，其特征在于它是按以下步驟進行：

步驟一：將經(jīng)酸化處理的多壁碳納米管與離子液體研磨混合20-30min，直至形成均勻的電極修飾液，按0.01-0.07uL/mm²的滴涂量將電極修飾液均勻涂敷于玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復(fù)合工作電極；其中，碳納米管與離子液體的質(zhì)量體積比為1mg:（15μL-25μL）；

步驟二：按4.5×l0⁴-5.5×l0⁴個/cm²的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/cm²DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的n個培養(yǎng)皿中，放于37℃、CO₂體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h-50h后，取出培養(yǎng)皿，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，用pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每個培養(yǎng)皿中按21-24μL/cm²的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液，在45-55℃水浴中原位裂解細(xì)胞25-35min，獲得細(xì)胞裂解液；

步驟三：用步驟一制備的納米復(fù)合工作電極分別檢測嘌呤堿基單體溶液、嘌呤堿基混合溶液和步驟二中得到的細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號，確定細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號中嘌呤堿基電化學(xué)信號所在的峰位；其中，納米復(fù)合工作電極工作條件為溫度25℃、pH=7.2、掃描速度100mv/s；所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為5×10-⁶-9×10-⁶M，溶劑為pH=7.0-7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.0-7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為5×10^-6-9×10^-6M；

步驟四：按4.5×l0⁴-5.5×l0⁴個/cm²的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/cm²DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的n個培養(yǎng)皿中，放于37℃、CO₂體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-26h后，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，然后將n個培養(yǎng)皿隨機均分成二組，一組加入含有質(zhì)量百分含量為0.03-0.13%的致突變劑的無血清DMEM培養(yǎng)液對細(xì)胞進行培養(yǎng)1-3h，做為加藥組；另一組用含有0.1%-0.5%DMSO的無血清DMEM培養(yǎng)液對細(xì)胞進行培養(yǎng)1-3h，做為陰性對照組；其中，二組無血清DMEM培養(yǎng)液的加入量均為0.2-0.25mL/cm²；

步驟五：將步驟四的兩組培養(yǎng)的細(xì)胞用緩沖液分別沖洗2-3次，然后加入DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，放于37℃、CO₂體積百分含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-9天，每12h或24h進行電化學(xué)檢測，然后以電化學(xué)檢測時間為橫坐標(biāo)，以在步驟三中嘌呤堿基電化學(xué)信號所確認(rèn)的峰位對應(yīng)的電壓下所測得的基因突變前和突變過程中細(xì)胞嘌呤核苷酸代謝電流信號為縱坐標(biāo)，建立HGPRT基因突變電化學(xué)信號變化規(guī)律圖，即完成一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測方法；其中，DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液加入量為0.2-0.25mL/cm²。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測方法，其特征在于步驟一中所述的碳納米管與離子液體的質(zhì)量體積比為1mg:20μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測方法，其特征在于步驟二中所述的原位裂解細(xì)胞加入的PBS緩沖溶液的加入量為24μL/cm²，pH=7.4，裂解溫度為50℃，時間為30min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測方法，其特征在于步驟三中所述的嘌呤堿基單體濃度均為8×10^-6M，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為8×10^-6M。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測方法，其特征在于步驟四中所述的致突變劑為ENU或EMS，質(zhì)量百分含量均為0.06%，DMSO質(zhì)量百分含量為0.1%。