[發明專利]龜紋瓢蟲的特異性分子標記DNA序列、鑒別引物、鑒定方法及鑒定試劑盒

有效

• 申請號: 201310487512.0
• 申請日: 2013-10-17
• 公開（公告）號: CN103667446A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 謝佳沁;張宇宏;吳紅勝;賀韻育;鄧從雙;龐虹
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域

本發明屬于生物化學與分子生物學領域，具體涉及龜紋瓢蟲的特異性分子標記DNA序列、鑒別引物、鑒定方法及鑒定試劑盒。?

背景技術

龜紋瓢蟲Propylaea?japonica(Thunberg,1781)屬鞘翅目、瓢蟲科，在我國大部分地區都有分布，是多種蚜蟲、葉蟬、飛虱等害蟲的重要捕食性天敵。龜紋瓢蟲適應性強，具有耐高溫、抗低溫、耐饑餓等特性，并對生物農藥也有一定的抗性。在我國，研究人員對其行為、生理功能都做了很多的研究，在生物防治應用中也做了相關的試驗，已發現該瓢蟲作為一種有效地天敵昆蟲在生產應用中有很高的價值。然而，龜紋瓢蟲成蟲鞘翅上的色斑變化很多，屬多形性物種，與鞘翅目、葉甲科的很多物種相似，從形態學上很難將其區分；在幼蟲階段，其形態不但與瓢蟲科其他許多種類相似，甚至于與有些害蟲相似，從形態學上更難進行鑒定。在我國被記錄的瓢蟲種類有750余種，作為害蟲天敵的捕食性瓢蟲是我國重要的利用和保護對象，而要對瓢蟲種類進行準確的鑒定區分，就必須進行解剖，在顯微鏡下對生殖器進行觀察、鑒定，一方面，對采集標本的完整性有很高要求，另一方面，需要相關的分類專家進行鑒定工作，耗時、耗力。近年來，利用分子生物學技術進行物種鑒定已經在一些珍惜物種及檢驗檢疫方面得到了應用，但對田間天敵昆蟲的種類鑒定鮮有報道。因此，為了更好地了解龜紋瓢蟲在田間的生物種群分布和數量，評價其控害效果，研究建立一種高效、快速、靈敏且準確度高的鑒定方法將會是害蟲生物防治領域的關鍵技術之一。?

發明內容

本發明的第一個目的是提供從龜紋瓢蟲基因序列中克隆的，能用于鑒定龜紋瓢蟲的特異性DNA序列。?

本發明根據龜紋瓢蟲EST序列設計COI基因的特異性引物并進行PCR擴增，獲得233bp的DNA特異性條帶，對其回收、克隆、測序后進行同源性比較，確定該特異性DNA序列可作為鑒定龜紋瓢蟲的特異性分子標記，用于龜紋瓢蟲的鑒定、區分近緣的天敵瓢蟲及形態上不易分辨的昆蟲，從而實現了本發明的目的。?

本發明的鑒定龜紋瓢蟲的特異性DNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

本發明的第二個目的提供一對能鑒定龜紋瓢蟲的特異性PCR引物，其特征在于，包括正向引物：ATAGGAGCTGGAACAGGTTGA（如SEQ?ID?NO.2所示）和反向引物：AGTAGAAGAAGAATTGCGGTGA（如SEQ?ID?NO.3所示）。?

本發明的第三個目的是提供一種能特異性鑒定龜紋瓢蟲的試劑盒，包括DNA提取試劑、PCR預混液和PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物包括正向引物：ATAGGAGCTGGAACAGGTTGA和反向引物：AGTAGAAGAAGAATTGCGGTGA。?

用此引物擴增田間采集的混合種群昆蟲的基因組DNA樣本，如有233bp擴增條帶，則為混合有龜紋瓢蟲物種的樣本。?

本發明的第四個目的是提供一種鑒定龜紋瓢蟲的方法，其特征在于，以正向引物：ATAGGAGCTGGAACAGGTTGA和反向引物：AGTAGAAGAAGAATTGCGGTGA作為PCR引物通過PCR方法對基因組DNA樣本進行擴增，如有233bp擴增條帶，則為混合有龜紋瓢?蟲物種的樣本。?

本發明有效彌補了傳統分類對標本完整性要求高、需要相關領域的專業分類專家、成本高、耗時長等問題，提供的PCR引物及鑒定方法，不僅能提高龜紋瓢蟲鑒定的效率和準確性，而且操作簡便快捷，適合于田間檢測葉甲科類和近緣瓢蟲科的混合種群中是否混有捕食性的龜紋瓢蟲，同時對室內養殖過程進行質量監控、對龜紋瓢蟲的生防效果進行準確評估等方面，具有重要的理論意義和應用價值。?

附圖說明

圖1為用設計的PCR引物對16種常見昆蟲DNA樣本進行PCR檢測的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；?