[發明專利]一種microRNA的超分支滾環擴增檢測方法

有效

• 申請號: 201310486552.3
• 申請日: 2013-10-17
• 公開（公告）號: CN103525932A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 魯衛平;郭仲莉;陳鳴;鄧少麗;唱凱;王豐;顧大勇;李發科;賈雙榮;何大莉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

1.一種microRNA的超分支滾環擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）逆轉錄引物的設計：逆轉錄引物是按照與靶microRNA堿基互補配對的原則所設計，使其3’端末尾6個堿基與靶microRNA3’端末尾6個堿基互補配對，并形成一種頸環結構；

2）鎖式探針的設計：鎖式探針以cDNA序列中的一段連續排列的堿基作為識別序列，其中5’端為15個堿基，3’端為25個堿基，5’端磷酸化；

3）根據鎖式探針的序列設計一對擴增引物CF₁、CF₂；

4）逆轉錄反應體系的建立：包含microRNA、逆轉錄引物、dNTPs、10×RT緩沖液、RNA酶抑制劑、逆轉錄酶、DEPC?H₂O；

5）鎖式探針連接體系的建立：包含步驟4）形成的逆轉錄產物、鎖式探針、TaqDNA連接酶、10×Taq?DNA連接酶緩沖液、ddH₂O；

6)超分支滾環擴增反應體系的建立：包含步驟5）形成的連接產物、dNTPs、CF₂引物、Bst?DNA聚合酶、10×Bst?DNA聚合酶緩沖液、ddH₂O；

7）超分支滾環擴增反應產物的檢測：取步驟6）形成的擴增產物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳觀察電泳條帶，若呈階梯狀分布，則該方法被成功建立。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中通過sanger數據庫獲得所要檢測的目標microRNA的堿基序列。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中，用DNAMAN?version6軟件來查看逆轉錄引物的頸環結構特征。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中除了與頸環結構的逆轉錄引物結合的microRNA的6個堿基外，cDNA中逆轉錄出的堿基序列全部設計在鎖式探針3’端的識別序列中。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中鎖式探針5’端特異性識別序列和3’端特異性識別序列的T_m值不同。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3）中一對擴增引物中的CF₁為與鎖式探針互補的cDNA，CF₂為鎖式探針連接序列中的一段序列。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述CF₂探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示；頸環引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，鎖式探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4）包含：逆轉錄反應體系的建立：15μL體系包含microRNA5μL、50nM逆轉錄引物3μL、0.25mM?dNTPs0.15μL、10×RT緩沖液1.5μL、20U/μL?RNA酶抑制劑0.19μL、50U/μL逆轉錄酶1μL、DEPC?H₂O4.16μL；16℃30min，42℃30min，85℃5min。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）包含：鎖式探針連接體系的建立：20μL體系包含步驟4）形成的逆轉錄產物15μL、100nM的鎖式探針2μL、40U/μL的TaqDNA連接酶0.2μL、10×Taq?DNA連接酶緩沖液2μL、ddH₂O0.8μL，46℃反應30min。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6）包含：超分支滾環擴增反應體系的建立：20μL體積包含步驟5）形成的連接產物10μL、10mM?dNTPs1μL、10μM?CF₂引物2μL、8U/μL?Bst?DNA聚合酶0.5μL、10×Bst?DNA聚合酶緩沖液2μL、ddH₂O4.5μL；65℃反應50min。