[發(fā)明專利]非標(biāo)記SNP檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310485829.0
• 申請(qǐng)日: 2013-10-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103614459A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡軍;方晨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州青山生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物分子檢測(cè)方法，特別涉及一種非標(biāo)記基因單核苷酸多態(tài)性(Single?Nucleotide?Polymorphism，SNP)檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

目前業(yè)界已經(jīng)發(fā)展出多種通過(guò)將生物分子連接于金納米粒子，鉑表面的金納米粒子，金電極、金納米薄膜等材料的表面，繼而構(gòu)建生物檢測(cè)試劑盒、傳感器或者三維納米結(jié)構(gòu)材料的技術(shù)。在現(xiàn)有的這些技術(shù)中，生物分子與金材料的連接通常是通過(guò)連接在生物分子上的單個(gè)或多個(gè)巰基對(duì)金表面的強(qiáng)吸附實(shí)現(xiàn)的，但因巰基化學(xué)穩(wěn)定性差，極易受氧氣、光照作用而降解，并產(chǎn)生副產(chǎn)物，繼而干擾后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行或影響試驗(yàn)的精密度。?

例如，對(duì)于現(xiàn)有的SNP檢測(cè)方法，其大多是通過(guò)將寡聚核苷酸探針連接于金納米粒子、金薄膜等基體上，再通過(guò)觀測(cè)該等寡聚核苷酸探針與目標(biāo)DNA的結(jié)合情況而實(shí)現(xiàn)的，但由于前述的缺陷，往往導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不甚理想。?

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種非標(biāo)記SNP檢測(cè)方法。?

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：?

一種非標(biāo)記SNP檢測(cè)方法，包括：?

(1)提供兩種以上寡核苷酸探針，并將其中至少一種寡核苷酸探針通過(guò)三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面；?

(2)將該兩種以上寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并加入目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)；?

(3)在雜交反應(yīng)過(guò)程中和/或在雜交反應(yīng)完成后，通過(guò)對(duì)雜交反應(yīng)體系和/或雜交反應(yīng)形成的產(chǎn)物的相關(guān)特征性參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。?

作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，步驟(1)包括：將兩種以上寡核苷酸探針?lè)謩e通過(guò)三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面，所述金基體包含金納米粒子。?

進(jìn)一步的，該方法包括：?

(2)將兩種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并分別加入目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針?lè)瞧ヅ湮稽c(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行雜交反應(yīng)；?

(3)對(duì)由所述目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針?lè)瞧ヅ湮稽c(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品與該兩種寡核苷酸探針?lè)磻?yīng)形成的雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)分別進(jìn)行檢測(cè)，并確定所述非匹配位點(diǎn)的數(shù)量與所述雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。?

作為具體應(yīng)用方案之一，步驟(3)中檢測(cè)所述雜交產(chǎn)物熔點(diǎn)的方法包括：將所述雜交產(chǎn)物置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，調(diào)整環(huán)境溫度，并實(shí)時(shí)測(cè)量吸收光譜隨溫度的變化情況，進(jìn)而測(cè)得所述雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)。?

作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，步驟(1)包括：將一種寡核苷酸探針?lè)謩e通過(guò)三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面，所述金基體包含金薄膜芯片。?

進(jìn)一步的，步驟(2)包括：?

i.將連接在金薄膜芯片上的一種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并加入目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測(cè)所述雜交反應(yīng)過(guò)程；?

ii.將另一種寡核苷酸探針加入步驟i形成的混合反應(yīng)體系中，并繼續(xù)進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測(cè)所述雜交反應(yīng)過(guò)程。?

作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，該方法包括：?

(2)?

i.將連接在金薄膜芯片上的一種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并分別加入目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的?序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針?lè)瞧ヅ湮稽c(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測(cè)所述雜交反應(yīng)過(guò)程；?

ii.將另一種寡核苷酸探針加入步驟i形成的混合反應(yīng)體系中，并繼續(xù)進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測(cè)所述雜交反應(yīng)過(guò)程；?

(3)確定所述SPR光譜參數(shù)變化與所述非匹配位點(diǎn)的數(shù)量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。?

具體而言，所述三硫代金剛烷衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式：?

其中，R包括任意基團(tuán)。?

進(jìn)一步的，所述三硫代金剛烷衍生物至少選自如下化合物中的任一種：?