[發(fā)明專利]對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的LAMP檢測(cè)引物組及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310485400.1
• 申請(qǐng)日: 2013-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN103540687A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紅梅;趙哲;劉助紅;唐大運(yùn);葉蕾;張璜;石磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的檢測(cè)方法，具體涉及一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的LAMP檢測(cè)引物組及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

白斑綜合征病毒(white?spot?syndrome?virus，WSSV)是1993年世界范圍內(nèi)對(duì)蝦暴發(fā)性流行病的主要病原，迄今仍然沒(méi)有能有效控制WSSV疫情的技術(shù)措施。國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，綜合預(yù)防是相對(duì)有效的方法，即盡早發(fā)現(xiàn)疾病并采取諸多措施阻止病毒傳播。因此，建立靈敏、準(zhǔn)確、快捷、方便的WSSV病原檢測(cè)方法是減少白斑綜合征發(fā)生和危害的重要途徑。目前WSSV病原的檢測(cè)方法主要有目視觀察法、組織學(xué)方法、電子顯微技術(shù)、生化檢驗(yàn)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。目前檢測(cè)方法正向更特異、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、費(fèi)用低廉化的方向發(fā)展，但這種方法耗時(shí)、特異性和靈敏度低，遠(yuǎn)不能滿足日常快速檢測(cè)工作的需要。自問(wèn)世以來(lái)，PCR?技術(shù)憑借靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，被普遍應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原的檢測(cè)中。但PCR?技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作要求苛刻，產(chǎn)物容易污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。與一般PCR?技術(shù)相比，熒光PCR?檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)化了操作步驟，而且可消除擴(kuò)增產(chǎn)物引起的交叉污染，減少假陽(yáng)性的發(fā)生。但實(shí)時(shí)熒光PCR?成本較高，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的常規(guī)病原體檢測(cè)中的應(yīng)用還不多。建立檢測(cè)WSSV快速準(zhǔn)確的方法，是適應(yīng)口岸快速檢測(cè)和大通關(guān)的時(shí)代要求，對(duì)促進(jìn)中國(guó)海洋養(yǎng)殖及其產(chǎn)品的貿(mào)易有重要作用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）是NOTOMI等建立的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在60~65?℃的恒溫條件下，歷時(shí)30~60?min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP?反應(yīng)中可形成明顯的白色焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)對(duì)濁度的觀察或加入熒光染料，直接通過(guò)顏色變化來(lái)判定反應(yīng)結(jié)果。該技術(shù)具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原體的檢測(cè)研究，并取得了較理想的效果。

德國(guó)QIAGEN公司研發(fā)的恒溫反應(yīng)及檢測(cè)儀器ESE-Quant?tube?scanner通過(guò)吸收熒光來(lái)實(shí)時(shí)判斷反應(yīng)的進(jìn)行。比傳統(tǒng)LAMP終點(diǎn)判斷產(chǎn)物的濁度或顏色變化更客觀可靠。由于過(guò)程的數(shù)據(jù)化和自動(dòng)化，可用于科研，開發(fā)新的檢測(cè)方法。由于其便攜、易操作，比起定量PCR儀，節(jié)約了大量成本，適合基層推廣檢測(cè)，符合疾病檢測(cè)的快速、準(zhǔn)確的診斷需要。

由于ESE-Quant?tube?scanner通過(guò)吸收熒光來(lái)判斷反應(yīng)是否進(jìn)行，前期研究發(fā)現(xiàn)，常用的熒光顯色劑SYBR?Green?I過(guò)于靈敏，在ESE-Quant?tube?scanner上常造成陰性反應(yīng)孔出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增曲線，影響結(jié)果判斷。尤其在樣品不純的情況下。此反應(yīng)對(duì)模板純度要求較高，如果樣品雜質(zhì)含量較多，ESE-Quant?tube?scanner上的擴(kuò)增曲線將呈現(xiàn)不集中，傾斜向上等。SYTO-9作為SYBR?Green?I的下一代產(chǎn)品熒光顯色劑可以避免上述缺陷。

對(duì)于WSSV病毒DNA的提取可采用研磨法提取上清中的病毒核酸，而不采用蛋白酶消化組織的方法。樣品為成年蝦的，主要采集消化腺、前足等，蝦苗則直接研磨。對(duì)于蝦仁的檢測(cè)，先用勻漿機(jī)對(duì)數(shù)個(gè)蝦仁進(jìn)行勻漿，再取少量蝦肉進(jìn)行研磨提取。這樣節(jié)省了蛋白酶作用的時(shí)間，更重要的是消除了大量雜質(zhì)及色素，減少了對(duì)后續(xù)LAMP反應(yīng)的抑制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的LAMP檢測(cè)引物組。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的LAMP檢測(cè)方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的LAMP檢測(cè)引物組，包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

WSSV-F3：ACAACACTGTGACCAAGAC（SEQ?ID?NO:1）；

WSSV-B3：GTTCCACACCTTGAATGTTC（SEQ?ID?NO:2）；

WSSV-FIP：CCCAAGGTGTCGCTGTCAACTGTGACTGCTGAGGTTG（SEQ?ID?NO:3）；

WSSV-BIP：CCGCAATGGAAAGTCTGATGCCACGGGAGTGATGACAAG（SEQ?ID?NO:4）；

WSSV-LF：CAGTCATCTTGAAGTAGCCTGA（SEQ?ID?NO:5）；