[發明專利]納米脂質體在生物轉化中的應用

在審

• 申請號: 201310485034.X
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103834609A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 葉麗;馮美卿
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N1/38
• 分類號: C12N1/38
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及納米脂質體在生物轉化中的應用。

背景技術

現有技術公開了利用微生物轉化疏水性化合物在實際應用中需要突破的瓶頸是底物的水不溶性造成投料濃度低，轉化效率不高。微生物轉化屬于兩階段發酵，其包括：首先需要將微生物菌種在液體培養基中培養適當時間（生長的中期或后期），積累轉化所需要的酶；然后投入需要轉化的底物啟動轉化。微生物菌種的液體培養通常在水相中進行，底物在水溶液中的溶解度直接關系到微生物轉化反應的效率，由于微生物轉化酶系一般屬于胞內酶，只有溶解到液相的底物才能與微生物細胞充分接觸進入細胞。在甾體微生物轉化過程中，存在一個普遍的現象是隨著投料濃度的提高，轉化率會明顯下降，這主要是因為過多的不溶性底物會對菌體生長和轉化產生抑制作用。目前解決這一問題的手段主要有機溶劑、表面活性劑、雙水相系統等。

納米脂質體技術通常應用于藥物制劑中，其中，可采用卵磷脂將難溶性藥物制備成納米脂質體，能顯著地提高藥物水溶性和生物利用度。納米脂質體作為藥物載體具有如下優勢：由磷脂雙分子包覆水相囊泡構成，生物相容性好；可將脂溶性藥物溶于脂膜內；磷脂本身是細胞膜成分，因此對生物體無毒性。另外基于其小尺寸而獲得的巨大比表面積使反應更容易進行。有研究顯示，在利用微生物降解甾醇邊鏈中，作為納米藥物載體的卵磷脂能夠改變細胞膜脂質雙層結構增加細胞膜的通透性，促進疏水性底物進入胞內，從而提高甾醇邊鏈降解轉化率?；诩{米脂質體的上述優點，本發明擬提供基于疏水性底物制備的納米脂質體在生物轉化中的新的應用。

發明內容

本發明的目的是提供納米脂質體技術的新應用，具體涉及納米脂質體技術在生物轉化中的新應用，尤其涉及基于疏水性底物制備的納米脂質體在生物轉化中的新的應用。

本發明中，采用卵磷脂為載體將疏水性底物制備成底物納米脂質體，再進行投料轉化。

本發明將疏水性底物制備成納米脂質體再進行生物轉化，能利用卵磷脂增加細胞膜通透性的特性，又能發揮納米脂質體生物相容性好、提高水溶性及巨大比表面積的優勢，促進底物向細胞內運輸，使其進入微生物細胞內的量增加，從而提高轉化體系底物投料濃度和轉化率。

本發明公開的納米脂質體技術在生物轉化中應用特別適合于疏水性化合物的微生物轉化，如甾醇微生物邊鏈降解、甾體微生物羥化反應等。

本發明中，所述的微生物轉化是指疏水性化合物的微生物轉化，或底物對微生物具有毒性、抑制微生物生長的微生物轉化。

本發明進一步的提供納米脂質體應用于生物轉化的新方法，其中，以左旋乙基甾烯二酮的微生物11α羥化反應為模型。

本發明中，所述的羥化反應是甾體微生物轉化反應中最重要的反應，能為甾體藥物化學合成提供重要中間體，鑒于甾體在水中極低的溶解度（低于0.1mM），其微生物轉化反應是生物轉化疏水性化合物的典型例。

左旋乙基甾烯二酮的11α羥基衍生物是制備強效孕激素去氧孕烯的關鍵中間體。去氧孕烯是口服避孕藥媽富隆的主要成分，由于媽富隆的副作用小，效果可靠，其應用已越來越廣泛。美國專利（US2005/0234251A1）公開的去氧孕烯合成工藝采用左旋乙基甾烯二酮為起始原料，首先利用Aspergillus?ochraceous經生物轉化引入11α羥基再進行一系列化學反應合成去氧孕烯。該專利以有機溶劑DMF溶解底物左旋乙基甾烯二酮投料，投料濃度2g/L-6g/L時，羥化反應轉化率為35%-60%。

本發明的生物轉化模型系采用金龜子綠僵菌突變株（Metarhizium?anisopliae）11490（CCTCC?M2011240），在左旋乙基甾烯二酮上引入11α羥基，所述菌株已申請專利，專利申請號201110199550.7。

更具體的，本發明的納米脂質體用于生物轉化的方法，其特征在于，該轉化方法包括下述步驟：

（1）制備底物納米脂質體

以卵磷脂為載體，將底物左旋乙基甾烯二酮(DES1)制成納米脂質體；優化處方和制備工藝后；考察納米脂質體的粒徑和結構、底物包封率及釋放情況。

（2）微生物轉化

微生物菌種：Metarhizium?anisopliae11490（菌種保藏號CCTCC?M2011240），該菌種能在左旋乙基甾烯二酮上引入11α羥基；

斜面培養：將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，其中添加質量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26～30℃培養5～10天；