[發(fā)明專利]小鼠粘蛋白5B大鼠單抗和酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310484346.9
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103499695B
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫穎;樂音譜;姚雯;楊娟;何峰容;李華淵;章秀波;汪景;劉曉樂
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢云克隆科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京匯澤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾;程殿軍

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種小鼠粘蛋白5B大鼠單抗和酶聯(lián)免 疫吸附測定試劑盒的制備方法的制備方法。

背景技術(shù)

粘蛋白5B，Mucin5SubtypeB(MUC5B)，是高度糖基化修飾的高分子量蛋白家族成員 之一。由核心蛋白和O-糖鏈組成，分子量約為40萬以上，在淚腺中表達(dá)并分泌，是唾液和淚 液中的主要黏蛋白成分之一。

粘蛋白5B為凝膠形成型粘蛋白，其單體可以纏結(jié)聚合形成線性多聚物，從而形成 凝膠錨定在眼表，它使得黏液層具有流變性質(zhì)，在眼瞼和眼球快速相對運(yùn)動時保護(hù)上皮免 受剪切力的破壞。同時，它可與各種微粒、化學(xué)物質(zhì)、微生物等產(chǎn)生非特異性的相互作用。可 在異物、壞死細(xì)胞等周圍形成小的凝膠，經(jīng)過鼻淚管把眼表的垃圾運(yùn)走。粘蛋白5B是淚膜必 不可少的成分，在維持淚膜穩(wěn)定方面有重要作用，檢測眼表粘蛋白的含量可作為評價淚膜 功能的一種方法。同時，它還在全唾液、正常肺粘液和宮頸粘液中起到潤滑性和粘彈性的作 用。而且，該蛋白已被發(fā)現(xiàn)是在一些人類疾病，包括鼻竇粘膜慢性鼻竇炎（CRS）與鼻息肉 CRS，慢性阻塞性肺疾病（COPD）和幽門螺桿菌相關(guān)胃病上調(diào)中起到重要作用。因此粘蛋白的 檢測對于干眼癥、鼻竇炎、肺癌、胃潰瘍等疾病的診斷、藥物療效的評估等均有一定的價值。

目前傳統(tǒng)的粘蛋白定量測定方法主要有高效液相色譜法、Western-blotting、RT- PCR、免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附測定法。

其中免疫印跡法（Western-blotting）是目前應(yīng)用于粘蛋白5B定量檢測的比較普 遍的方法，這種方法可以初步測定粘蛋白5B的含量，但它測得的是μg/mL以上的含量，操作 簡單，但需要做SDS-PAGE電泳和用考馬斯亮藍(lán)染色和脫色，中間過程繁多，影響因素也很 多，穩(wěn)定性較差，而且最后只能通過目標(biāo)條帶灰度值估測定量，結(jié)果不是很準(zhǔn)確，并且一次 性只能檢測少數(shù)樣本，臨床上使用較少；而使用免疫組織染色檢測粘蛋白5B雖然也可以測 得μg/mL以上的含量，但由于現(xiàn)今免疫組織染色中還存在著一些問題，比如說組織固定問 題，抗原修復(fù)問題以及陽性對照問題等，這些問題也嚴(yán)重制約了免疫組織染色方法的發(fā)展 和普及；RT-PCR主要通過檢測mRNA來預(yù)測粘蛋白5B的量，需要使用熒光定量PCR儀，一次性 投資大，價格昂貴，不適合一般實驗室使用。

高效液相色譜法（HPLC）具有靈敏度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好等優(yōu)勢，但需要昂貴的 儀器設(shè)備，而且檢測過程繁瑣、樣本前處理的技術(shù)要求很高，難于操作。檢測人員需要具備 專業(yè)的檢測技能和豐富的實驗經(jīng)驗。

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測技術(shù)是在RIA基本理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種 非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。利用抗原-抗體之間特異性的免疫反應(yīng)識別生物液體中的靶 分子，并利用酶-底物的顯色反應(yīng)定量的反應(yīng)待測樣本中靶分子的含量。由于其特異性強(qiáng)、 靈敏度、操作簡便及不需大型儀器等優(yōu)點，現(xiàn)廣泛用于生物樣本的定量檢測實驗中。酶聯(lián)免 疫吸附測定檢測試劑盒中的關(guān)鍵因素是獲得高特異性、高親和力的單克隆抗體。目前小鼠 是科研實驗室最常用的實驗動物，但由于粘蛋白5B來源于小鼠，所以常規(guī)的小鼠單克隆抗 體的制備方法在這里是行不通的。而大鼠單抗的制備則可以解決這個問題，同時大鼠抗體 具有一些小鼠抗體不具備的特點，大鼠抗體分子的輕鏈95%為κ型。因此可以利用小鼠抗大 鼠抗體Igκ-1a抗體，高度特異性地結(jié)合雜交瘤產(chǎn)生的Igκ-1a的單克隆抗體，然后達(dá)到去除 宿主大鼠產(chǎn)生的非特異性Igκ-1b抗體的目的，從而分離純化得到高純度的抗體。因此，本申 請是利用大鼠雜交瘤技術(shù)制備小鼠及其他物種的蛋白的單克隆抗體，然后用于ELISA試劑 盒研發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種小鼠粘蛋白5B大鼠單抗和酶聯(lián) 免疫吸附測定試劑盒及其制備方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面涉及一種小鼠粘蛋白5B大鼠單抗和酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制 備方法，其特征在于所述的試劑盒包括粘蛋白5B以及連接于固相載體上的抗體結(jié)合，生物 素化的粘蛋白5B多克隆抗體，HRP標(biāo)記的親和素，底物TMB和終止液，所述的制備方法包括如 下步驟：