[發明專利]一種分離岡崎片段的方法

無效

• 申請號: 201310483404.6
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103525807A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 楊文超;李鑫輝;邵志峰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

1.一種用于提取酵母岡崎片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(a)提供一含酵母細胞DNA的樣品；

(b)對所述的含酵母細胞DNA的樣品，采用氯化銫提取法進行分離純化，從而得到含酵母細胞DNA的第一純化產物；

(c)在所述的第一純化產物中加入(i)一單鏈DNA序列和(ii)一5′端帶有RNA引物的單鏈DNA序列作為參照序列，形成第一混合物；

(d)對所述第一混合物，采用蔗糖梯度離心進行分離，從而得到長度在500nt以內的DNA物質的第二純化產物；

(e)對所述的第二純化產物，進行磷酸化處理，然后采用RNA核酸酶進行酶切處理，再用核酸外切酶進行酶切處理，從而形成酶切混合物，其中所述酶切混合物中殘留的未被酶解的核酸序列即為岡崎片段；

(f)任選地從所述酶切混合物中分離所述的岡崎片段，

其中，在步驟(c)中，所述單鏈DNA序列的加入量為20-100ng；所述5′端帶有RNA引物的單鏈DNA序列的加入量為20-100ng。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈DNA序列和所述5′端帶有RNA引物的單鏈DNA序列的長度均≤400nt。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述5′端帶有RNA引物的單鏈DNA序列的5′端帶有至少8個核糖核酸堿基，用于模擬岡崎片段的RNA頭。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈DNA序列如SEQ?ID?NO:2所示；所述5′端帶有RNA引物的單鏈DNA的序列如SEQ?ID?NO:1所示。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈DNA序列的加入量為20-50ng；所述5′端帶有RNA引物的單鏈DNA序列的加入量為20-50ng。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)采用蔗糖密度梯度或濃度依次為5%、10%、15%、20%、25%和30%的蔗糖梯度進行離心分離，其中所述濃度為質量體積濃度(g/100ml)，并采用電泳對離心回收的DNA進行檢測，收集400nt以內的目標片段。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，先用T4多聚核苷酸激酶對5′頭的羥基進行磷酸化的反應，再利用RNA核酸酶進行酶切處理，從而去除核酸序列5′頭的RNA以及殘留的RNA。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)中進行核酸外切酶反應時添加λ核酸外切酶和λ核酸外切酶緩沖液，所述λ核酸外切酶緩沖液的pH為9.3-9.6。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述λ核酸外切酶緩沖液的pH為9.4。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟(f)中：采用電泳對所述岡崎片段進行檢驗，并采用酚/氯仿提取回收所述岡崎片段。