[發明專利]一種紅鰭東方魨卵巢細胞系體外構建方法及其應用

無效

• 申請號: 201310482371.3
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103555653A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 張博;宋文平;劉克奉;鄭德斌;陳松林
• 申請（專利權）人: 天津渤海水產研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓奎勇

1.一種紅鰭東方魨卵巢細胞系體外構建方法，其特征在于步驟如下：

（1）原代細胞培養液的制備：具體步驟包括：

①基礎培養基制備：1000ml?MEM和L-15培養基以2:1混合后的基礎培養基，稱取2.38g?Hepes，溶解于超純去離子水中，磁力攪拌混勻后，調節pH在7.5，然后抽濾滅菌后，為基礎培養基；

②紅鰭東方鲀卵巢細胞完全培養基的制備：將占總體積20%的胎牛血清、1%的大菱鲆血清、占總體積0.1%的2-巰基乙醇、2ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol/L的丙酮酸鈉及1nmol/L的谷氨酰胺加入到基礎培養基中，由此制成紅鰭東方鲀卵巢細胞完全培養基；

（2）原代培養：具體步驟包括：

①試驗魚選取：選取魚齡為一年的體重約500g的健康雌性紅鰭東方鲀；

②試驗魚暫養：用含1000單位/毫升的青霉素和1000單位/毫升鏈霉素過濾消毒海水，用無菌海水暫養停止投喂的實驗魚，待實驗魚停止排遺達24h以上時，用撈網迅速將紅鰭東方鲀取出置于75%酒精中浸泡2min；

③卵巢獲取及接種：將昏迷后的試驗魚在超凈工作臺中無菌解剖，取出卵巢，置于一次性的3.5cm培養皿中，PBS沖洗一次，70%酒精浸泡消毒3min后，PBS沖洗兩次，用無菌眼科剪將性腺組織剪成大約1cm³及以下的小塊；然后用0.75%的胰酶將剪碎組織塊消化15分鐘，PBS沖洗，過濾組織塊，用無菌的200ul移液器吸頭輕輕的吸取組織塊，接種在25cm²的培養瓶中，接種時要均勻，盡量使多的組織塊布滿瓶底，平均每瓶中接種數量為5×6=30塊；

④原代培養：將培養瓶翻轉，加入完全培養基2ml，倒置于24℃培養箱中培養，3h組織塊貼壁后，輕輕翻轉培養瓶，將培養瓶正置，輕晃培養瓶，使各組織塊浸到培養液中，24h后補加完全培養液至4ml，隔天觀察細胞貼壁及生長狀態，每隔5天更換完全培養基的2/3，每次更換時吸出脫壁的組織塊，約兩周遷出的細胞長滿瓶底后，進行傳代培養；

（3）傳代培養：原代培養細胞以組織塊為中心形成細胞集落，從而使整個瓶底細胞連成單層的一片，以0.25%的胰酶短暫消化細胞，迅速吸出，加入培養基吹打使細胞懸浮，以一瓶傳兩瓶的方式進行傳代；根據細胞生長狀態，5-7天可傳代一次；傳至第30代時，細胞基本生長穩定，可以進行相關生理數據的測定；

（4）不同形態細胞系的分離：組織塊接種時，隨著細胞貼壁擴繁，逐步呈現出兩種形態的細胞：一種為梭形上皮樣細胞，另一種為鵝卵石形上皮樣細胞，依據二者不同的貼壁附著特性，通過消化時間差異化處理，逐步將兩種細胞分離，至第三代完全分離完成，形成兩個紅鰭東方鲀雌性卵巢細胞系，即TSOC1和TSOC2。

2.根據權利要求1所述的紅鰭東方魨卵巢細胞系體外構建方法，其特征在于：所述步驟（1）中③卵巢獲取及接種的剪組織過程中滴加一滴完全培養基潤濕組織塊，防止組織在培養皿中干涸。

3.根據權利要求1所述的紅鰭東方魨卵巢細胞系體外構建方法，其特征在于：所述步驟（3）傳代培養中如果不需要細胞繼續快速繁殖，可以將完全培養基中血清含量減為總體積的15%。

4.一種紅鰭東方魨卵巢細胞系在魚類病毒增殖方面的應用，其特征在于步驟如下，

（1）首先檢測如上所述構建的兩個紅鰭東方鲀雌性卵巢細胞系，即TSOC1和TSOC2對牙鲆淋巴囊腫病毒和大菱鲆虹彩病毒的敏感性；

（2）將上所述構建的兩個紅鰭東方鲀雌性卵巢細胞系TSOC1和TSOC2細胞系應用于魚類病毒增殖及擴繁技術領域中。

5.一種紅鰭東方魨卵巢細胞系在轉基因研究中的應用，其特征在于步驟如下，

（1）首先檢測如上所述構建的兩個紅鰭東方鲀雌性卵巢細胞系，即TSOC1和TSOC2對轉染pEGFP-N3的表達；

（2）將上所述構建的兩個紅鰭東方鲀雌性卵巢細胞系TSOC1和TSOC2應用于轉基因研究技術領域。