[發(fā)明專利]一種舒伯特氣單胞菌快速檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310482323.4
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103571950A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈錦玉;潘曉藝;尹文林;郝貴杰;姚嘉赟;徐洋;藺凌云;袁雪梅
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 梁寅春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靶DNA片斷的檢測技術(shù)，具體涉及一種舒伯特氣單胞菌快速檢測試劑盒及用該試劑盒檢測舒伯特氣單胞菌的方法。

背景技術(shù)

舒伯特氣單胞菌(Aeromonas?schubertii)屬氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭氏陰性桿菌，單極鞭毛，運(yùn)動極為活潑。該菌廣泛存在于淡水、海水、土壤、魚類和脊椎動物腸道中，人類接觸后可引起感染，是急性腹瀉的重要致病菌。然而有關(guān)該菌的檢測試劑盒和檢測技術(shù)雖已有專利申請（申請?zhí)枺?01210467910.1，名稱：“一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測引物組、試劑盒及方法”）披露，但該申請的試劑盒和檢測技術(shù)僅適用于“鱧源舒伯特氣單胞菌”，對其它宿主來源的舒伯特氣單胞菌并不都能準(zhǔn)確檢測，根據(jù)對該申請的核心檢測引物“gyrB引物對”的分析發(fā)現(xiàn)，該引物對與部分水產(chǎn)動物來源的舒伯特氣單胞菌對應(yīng)基因不能很好的匹配，如GeneBank數(shù)據(jù)庫中的HQ731455、HQ731454、HQ731457、JQ319030。而本發(fā)明的核心引物組對所有已公布序列的舒伯特氣單胞菌對應(yīng)基因序列特異并完全彌合。因此本發(fā)明根據(jù)舒伯特氣單胞菌基因組中特異保守區(qū)域設(shè)計(jì)適用于組裝試劑盒的引物，并結(jié)合組織和細(xì)菌基因組提取試劑建立了舒伯特氣單胞菌檢測試劑盒，彌補(bǔ)了該技術(shù)領(lǐng)域不能解決對所有來源舒伯特氣單胞菌檢測的缺陷。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法的建立為水產(chǎn)動物舒伯特氣單胞菌的快速診斷和病原調(diào)查提供了技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

為解決傳統(tǒng)的舒伯特氣單胞菌鑒定方法費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確率低的問題，本發(fā)明提供一種舒伯特氣單胞菌快速檢測試劑盒及其檢測方法。根據(jù)舒伯特氣單胞菌基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用兩步法PCR技術(shù)研制舒伯特氣單胞菌快速檢測試劑盒和檢測方法。該方法不但具有檢測效率性，更具有檢測的特異性，對同屬的其它氣單胞菌無交叉反應(yīng)，擴(kuò)增目的片段大小適中，檢測技術(shù)中PCR程序的退火和擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行，大大降低了反應(yīng)時(shí)間，并增加了反應(yīng)特異性。該試劑盒可以以組織樣品初提的DNA為起始物進(jìn)行檢測，利于臨床試劑盒的應(yīng)用。這也彌補(bǔ)了現(xiàn)今缺乏普適性的舒伯特氣單胞菌檢測試劑盒的空白。

為解決上述問題，本發(fā)明包括一種舒伯特氣單胞菌快速檢測試劑盒以及用該試劑盒檢測舒伯特氣單胞菌的方法。

本發(fā)明一種舒伯特氣單胞菌快速檢測試劑盒，由DNA提取試劑和PCR反應(yīng)試劑組成，其特殊之處是所述DNA提取試劑和PCR反應(yīng)試劑分別為：

（1）DNA提取試劑成分為5-15mM?Tris、0.5-1.5mM?EDTA的pH8.0的TE緩沖液；蛋白酶K，濃度15-20mg/mL；100%的氯仿；100%的異丙醇；乙醇，濃度70%；雙蒸水；

（2）PCR反應(yīng)試劑分裝于若干反應(yīng)管，每個(gè)PCR反應(yīng)管中含有10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，濃度為10μM的dNTPs0.5μL，濃度為5U/μL的Taq?DNA聚合酶0.3μL，濃度為10μM的特異性寡核苷酸引物A0.5μL，10μM的特異性寡核苷酸引物B0.5μL，滅菌去離子水19.2μL，其中——

引物A：5’-CAGCGAGGAGGAAAGGTTGGTGGT-3’，

引物B：5’-AAGCCACGCCTCAAGGGCACAA-3’。

本發(fā)明用所述的試劑盒檢測舒伯特氣單胞菌的方法，步驟為：（1）用所述提取試劑提取樣品中的DNA；（2）用所述反應(yīng)試劑對所述DNA作PCR擴(kuò)增；（3）所述擴(kuò)增產(chǎn)品作凝膠電泳；其特殊之處是所述PCR擴(kuò)增過程為95℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，68℃復(fù)性延伸30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸5～10min；所述凝膠電泳后觀察到413bp擴(kuò)增產(chǎn)物。

本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的舒伯特氣單胞菌特異性檢測引物，是根據(jù)GenBank中氣單胞菌屬25個(gè)種的對應(yīng)基因組序列，以及所有已公布基因組序列的18株舒伯特氣單胞菌，進(jìn)行序列相似區(qū)比對和排列，尋找針對舒伯特氣單胞菌核苷酸序列保守區(qū)域和位點(diǎn)作為引物設(shè)計(jì)區(qū)，設(shè)計(jì)對舒伯特氣單胞菌特異的引物(引物A和引物B)。國內(nèi)外尚未見對所有來源舒伯特氣單胞菌特異檢測引物設(shè)計(jì)的研究報(bào)道。