[發明專利]一種無動物源的低蛋白培養基

有效

• 申請號: 201310481858.X
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103484426A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 劉吉;孫麗霞;李劍鳳;王桂江;劉傳磊;張建軍;朱蕾
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

技術領域

本發明屬于生物材料領域，具體涉及一種適于CHO細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無動物源的低蛋白培養基。

背景技術

以中國倉鼠卵巢(chinese?hamster?ovary，CHO)細胞為代表的真核表達系統是現代制藥工業的重要組成部分，與其他表達系統相比，它具有許多優點:第一，具有高效的重組基因擴增和表達能力；第二，有準確的轉錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子；第三，很少分泌自身的內源蛋白，具有產物胞外分泌功能，便于下游產物分離純化；第四，CHO細胞屬于成纖維細胞，既可以貼壁生長，也可以懸浮生長。即CHO細胞既可以貼壁生長在微載體介質表面，也可以懸浮生長在發酵罐中。微載體作為一種新興的利用CHO細胞貼壁附著在微載體上進行細胞培養的技術，廣泛地應用于組織工程中種子細胞的擴增（王常勇.采用微載體技術大規模培養組織工程種子細胞[J].生物醫學工程與臨床，2002，6(1)：51254.）；發酵罐或生物反應器等大規模懸浮培養CHO細胞的技術，以其易于擴大化等優勢，也在工程細胞培養中得到了廣泛應用。（陳志南，楊向民.基于抗體等重組蛋白表達產品的哺乳動物細胞大規模發酵技術[J].中國醫藥生物技術，2009，4（5）：325－328.）兩種培養方式均在重組藥物的研究中占據重要的位置。從這個角度來講，研發一種既滿足CHO細胞不同生長方式，同時又適合其大規模高密度擴增的培養基具有重要的應用價值。

此外，傳統的CHO細胞貼壁培養是在含8%～10%牛血清的培養基中擴增培養，血清雖然營養成分豐富，但是有很多不足的地方：第一，血清各批次間差異很大，其成分不能保持一致；第二，血清或血清來源的物質，如血清白蛋白、轉鐵蛋白、胰島素或其他外源性物質中可能存在支原體或病毒等污染物，會對細胞產生毒害作用；第三，血清組分復雜，給產品純化帶來了巨大困擾，不利于產品質量的提升；第四，由于組分不明確，很難根據不同細胞株設計和優化能夠支持其高密度培養和高水平表達的培養基。

綜上可知，在CHO無血清培養基中摒棄動物來源成分，同時盡可能降低培養基中的蛋白質含量，無論從產品產量還是質量角度來講都是開發CHO無血清培養基的主流方向。

關于無血清培養基的開發，已經有過許多嘗試：

Gyun?Min?Lee等人（Gyun?M?L，Eun?J?K，No?S?K，et?al.Development?of?a?serum-free?medium?for?the?production?of?erythropoietin?by?suspension?culture?of?recombinant?Chinese?hamster?ovary?cells?using?a?statistical?design[J].Journal?of?Biotechnology，1999（69）：85-93.）開發了無血清培養基，以IMDM培養基為基礎培養基，添加了2mg/LFe(NO₃)₃·9H₂O、0.0025mg/L?CuCl₂、和1mg/LZnSO₄·7H₂O作為微量元素，同時添加了2.5-5mg/L胰島素，10-20mg/L轉鐵蛋白等營養物質，用于表達EPO的CHO工程細胞的懸浮培養。

Chi?Hsien?Liu等人（Chi?H?L，I-Ming?C，Shiaw?M?H，et?al.Factorial?designs?combined?with?the?steepest?ascent?method?to?optimize?serum-free?media?for?CHO?cells[J].Enzyme?and?Microbial?Technology，2001，28：314-321.）開發了無血清培養基，以IMDM培養基為基礎培養基，添加了1%SITE（硒，胰島素，轉鐵蛋白，乙醇胺），0.3g/L酵母抽提物，0.09%亞麻油脂-牛血清白蛋白，用于CHO細胞的無血清懸浮培養，這些添加物能夠很好的促進CHO細胞生長。