[發(fā)明專利]一種胞外α-酮戊二酸產(chǎn)量提高的解脂亞洛酵母基因工程菌

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310481832.5
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103484391A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);郭洪偉;周景文;堵國成
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/31;C12N15/63;C12P7/50;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種胞外α-酮戊二酸產(chǎn)量提高的基因工程菌，其特征在于，是在解脂亞洛酵母（Yarrowia?lipolytica）WSH-Z06中過量表達(dá)編碼酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述編碼酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的核苷酸序列如以下（1）或（2）或（3）或（4）所示：

（1）NCBI登錄號為YALI0B19470g的核苷酸序列，

（2）NCBI登錄號為YALI0C21406g的核苷酸序列，

（3）NCBI登錄號為YALI0D20108g的核苷酸序列，

（4）NCBI登錄號為YALI0E32901g的核苷酸序列。

3.構(gòu)建權(quán)利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

（1）構(gòu)建表達(dá)目的基因所用的含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶為篩選標(biāo)記的整合型表達(dá)載體p0(hph)；

（2）構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒：根據(jù)NCBI公開的序列，全化學(xué)合成目的酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的開放閱讀框部分，并通過限制內(nèi)切酶同時切割獲得的基因和整合型表達(dá)載體p0(hph)，連接酶切產(chǎn)物獲得重組表達(dá)質(zhì)粒；

（3）將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y.lipolytica?WSH-Z06：利用電穿孔轉(zhuǎn)化方法將被線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型Y.lipolyticaWSH-Z06，進(jìn)行驗(yàn)證篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

4.利用權(quán)利要求2所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其特征在于，將所得重組基因工程菌接種至種子培養(yǎng)基中，28℃、200rpmin，培養(yǎng)16-18小時；按10%的接種量從種子培養(yǎng)基中接種到3L發(fā)酵罐中，溫度為28℃、通氣量為1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為400rpm，培養(yǎng)144-168小時。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1g/L，調(diào)pH為5.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：甘油100g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O1.2g/L，NaCl0.5g/L，K₂HPO₄0.1g/L，鹽酸硫胺素2×10^-7g/L，調(diào)pH為5.0后再加入20g/L?CaCO₃。