[發明專利]一種融合標簽蛋白

有效

• 申請號: 201310481574.0
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103554245A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 夏斌;段博;陳安琦
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11360
• 代理人: 李稚婷

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種新型的融合標簽蛋白，以及基于該融合標簽的新型融合蛋白表達系統。

背景技術

將外源基因轉入大腸桿菌等宿主細胞中表達以獲得相應的目的蛋白，是科研以及生產過程中獲取所需蛋白質的重要方法之一。大腸桿菌作為蛋白表達的宿主細胞有很多優點：比如易于繁殖，蛋白表達量高且價格便宜。但是它也有很多局限性，例如：一些異源蛋白在大腸桿菌體內表達時表達量很低，一些蛋白表達后易于降解，或者表達的外源蛋白對宿主細胞具有毒性，導致細菌生長停滯或死亡。或者雖然表達量較高，但表達時蛋白尚未正確折疊便聚合在一起形成包涵體。對包涵體進行體外變復性實驗使其重新折疊的方法不僅復雜，而且難以保證變復性后蛋白的結構與正常生理狀態下一致。

選擇合適的表達載體和宿主細胞，或優化表達溫度和時間等方法可以使一些蛋白的表達情況得到改善，但很多時候仍然難以湊效。目前使用較為廣泛的方法是利用具有促表達以及促溶作用的標簽蛋白與目的蛋白融合表達。

有一些蛋白質在大腸桿菌中表達時表達量很高，而且能夠正確折疊成可溶性蛋白，性質穩定，常被用作標簽蛋白與目的蛋白融合在一起表達。此類標簽蛋白被稱為SETs(Solubility-Enhancing?Tags)，目前已發現了多種SETs，例如Trx、GST、MBP、NusA、SUMO、GB1等等(Esposito，D.and?D.K.Chatterjee(2006).″Enhancement?of?soluble?protein?expression?through?the?use?offusion?tags.″CurrOpinBiotechnol17(4)：353-358.)。但此類標簽蛋白究竟如何幫助目的蛋白的表達和折疊，機理目前尚不十分明確，且這些SETs不能幫助所有的蛋白質表達和折疊。對于某種難以表達的蛋白，我們可能需要嘗試使用不同的SETs以找到合適的表達條件。

HREV107(又稱H-REV107-1，H-REV107-3和HRSL3)是腫瘤抑制因子H-REV107家族蛋白中的一員。它在正常的組織中廣泛表達，但在癌細胞中的表達受到明顯的抑制。H-REV107的大量表達可以抑制腫瘤細胞的生長并且誘導細胞凋亡(Ren，X.，J.Lin，C.Jin?and?B.Xia(2010).″Solution?structure?of?the?N-terminal?catalytic?domain?of?human?H-REV107--a?novel?circular?permutated?NlpC／P60domain.”FEBS?Lett584(19)：4222-4226.)。

H-REV107由親水的N端結構域和疏水的C端結構域構成，分別具有不同的功能：N端結構域具有磷脂酶活性；C端是跨膜結構域，與細胞定位有關，并能夠抑制腫瘤生長。HREV107親水性的N端(1-125個殘基)在大腸桿菌中表達時可溶表達量很高而且性質穩定。據此，我們研究了HREV107N作為一新型融合標簽的可能性，并依據其結構特點構建了一種新型的融合標簽以及相應的融合蛋白表達系統。

發明內容

本發明目的在于提供一種新型的融合標簽蛋白以及基于此標簽蛋白所構建的新型融合蛋白表達系統。

所述新型融合標簽蛋白涉及一種新型融合蛋白構建方法，此方法也在本發明所保護的范圍之內。

本發明所提供的新型融合標簽蛋白以HREV107的N端結構域(第1-125位殘基)(記為HREV107N)為基礎構建。本發明所述HREV107N的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?No：1所示。與野生型序列相比，本發明所述HREV107N序列中第89位為絲氨酸，而野生型序列該位置為半胱氨酸，即本發明所述HREV107N是其野生型的C89S突變體。此突變是為避免原有半胱氨酸殘基參與形成二硫鍵，突變后蛋白整體結構不受影響。

本發明還涉及HREV107N的編碼基因，其編碼基因可以是序列表中SEQ?ID?No：2所示的DNA分子。當然，由于密碼子的簡并性，其它與SEQ?ID?No：2所示核苷酸序列同源且編碼相同氨基酸序列的DNA分子也可用于構建本發明的融合標簽蛋白。

HREV107的N端結構域在大腸桿菌中表達時可溶表達量很高而且性質穩定，故可作為一種潛在的具有促溶作用的標簽蛋白。HREV107N蛋白質結構如圖1所示。其結構中存在一段較長的無規卷曲(P38-K57)，這段區域不參與疏水核心的構建，獨立地伸展在外。