[發明專利]金黃色葡萄球菌ITC融合蛋白及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310480520.2
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103570835A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 崔玉東;朱戰波;于立權;陳龍欣;李閏婷
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K39/085;A61P31/04
• 代理公司: 大慶市建華專利事務所 23119
• 代理人: 孫薇

技術領域

本發明屬于分子生物學和基因工程領域，涉及一種金黃色葡萄球菌ITC融合蛋白及制備方法和應用，即將IsdB免疫優勢片段和Trap以及ClfA免疫優勢片段N3區域融合而成的ITC融合蛋白及制備方法和應用。

背景技術

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus,S.aureus）是一種革蘭氏陽性菌，既是引起人類多種感染的主要病原菌，也是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。但隨著臨床上抗生素在S.aureus感染治療中的普遍使用，已出現了大量S.aureus耐藥菌株，致使抗生素治療收效甚微，甚至毫無效果。因此，對S.aureus感染的免疫預防和免疫治療成為人們現在研究的焦點。在過去的40多年里，人們對S.aureus全菌滅活苗、莢膜多糖結合苗、類毒素、菌體表面粘附素以及菌體結構蛋白亞單位苗等作了大量研究，但免疫保護效果都不令人滿意。近年來，隨著對S.aureus認識的不斷深入和對S.aureus苗的研究探索，使人們意識到使用單一抗原分子作為免疫原進行免疫，其所提供的免疫保護作用有限。而使用S.aureus多種以上抗原制成疫苗會使免疫保護作用得到進一步提高。

Isd是S.aureus鐵調節表面決定簇（Iron-regulated?surface?determinant）的縮寫，包括IsdB、IsdA、IsdH等多個成分。Kuklin等報導，Isd家族成員——IsdB在各種S.aureus株中高度保守，將表達的IsdB用硫羥磷酸鋁佐劑制備免疫原免疫小鼠，證實該疫苗具有高度的免疫原性，能顯著降低小鼠致死率。TraP(Target?of?RNAIII?Activating?Protein)是一個由167個氨基酸殘基組成的蛋白質，在葡萄球菌中高度保守。它能夠被RNAIII激活蛋白（RAP）激活，而且研究認為TraP在葡萄球菌應激反應中發揮作用，可保護DNA免受氧化損傷、自然突變和適應性突變。本實驗室曾對表達的IsdB、TraP和RAP的免疫保護作用進行了比較研究，結果IsdB、TraP和RAP均能夠刺激小鼠產生良好的體液免疫應答和高水平的細胞因子（IL-4、IFN-γ），在小鼠敗血癥模型中用不同菌株攻毒，其免疫保護效果TraP略優于IsdB，IsdB略優于RAP。本實驗室的進一步研究證實，將IsdB免疫優勢片段126-361aa與TraP進行融合表達，獲得的融合蛋白的免疫原性和免疫保護作用得到進一步提高。ClfA是凝集因子A（clumping?factor?A，ClfA）的縮寫，是S.aureus黏附于寄主細胞的最主要的黏附因子之一。ClfA可以介導S.aureus黏附到宿主基質蛋白上，也可以與纖維蛋白原結合而使S.aureus得到保護，從而起到抗吞噬作用，而且ClfA幾乎表達于所有的S.aureus表面。ClfA由933個氨基酸殘基構成，分為S、A、R、W、M和C區。其中A區結構域共約500個氨基酸殘基組成，可分為三個亞區，即N1、N2和N3。經研究證實ClfA的N2N3具有免疫保護作用，可以用于治療或預防S.aureus感染。目前，使用上述幾種抗原聯合起來制備預防金黃色葡萄球菌感染的疫苗還未見報道。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種金黃色葡萄球菌ITC融合蛋白，將金黃色葡萄球菌的多種抗原進行串聯表達，克服現有的單一抗原分子作為免疫原進行免疫，其所提供的免疫保護作用有限的問題。

本發明的第二目的是提供上述ITC融合蛋白的編碼基因。

本發明的第三目的是提供上述ITC融合蛋白的制備方法。

本發明的第四目的是提供上述ITC融合蛋白的用途。

本發明通過以下技術方案來實現：

一、一種金黃色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫優勢片段(IsdB_id)和Trap以及ClfA免疫優勢片段N3區(ClfA_N3)融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

二、編碼上述的ITC融合蛋白的基因，其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

三、上述的ITC融合蛋白的制備方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

（1）ClfA優勢片段的篩選，得到ClfA_N3；

（2）金黃色葡萄球菌IsdB_id、TRAP、ClfA_N3的基因克隆；