[發明專利]以X射線單次測量實現對稱性微納米樣品三維成像的方法

有效

• 申請號: 201310479860.3
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103487452A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 江懷東;范家東;孫智斌;劉宏
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N23/20
• 分類號: G01N23/20
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明屬于X射線成像方法技術領域，尤其涉及一種單次測量具有對稱性微納米樣品的二維衍射數據來實現樣品結構三維重建的X射線成像方法。

背景技術

隨著同步輻射光源亮度的不斷提高，X射線成像方法得到了快速的發展，新的X射線成像方法不斷涌現，成像分辨率也在進一步提高。由于X射線具有波長短，穿透能力強的特點，是進行高分辨三維成像的理想光源。目前Micro-CT和Nano-CT成像技術已經日趨成熟，分別可以獲取大樣品的微米分辨率三維結構和較小樣品的納米分辨率的三維結構。但是由于X射線難以聚焦，目前的X射線CT的最高成像分辨率不超過30nm。利用第三代和第四代同步輻射光源高相干性和高亮度的特點，相干X射線衍射成像方法得到了廣泛的重視和快速的發展。由于相干X射線衍射成像方法不以透鏡為成像元件，擺脫了透鏡質量對成像分辨率的限制，理論上可以達到原子分辨率。將相干X射線衍射成像方法與斷層掃描成像方法相結合，目前可以獲得10nm分辨率的三維成像結果。

但是無論以上何種成像方法，在實現樣品三維成像的過程中均需要測量大量的投影，不僅增加了數據采集時間，而且也會由于長時間曝光而對樣品產生嚴重的輻射損傷。尤其對于生物樣品來說，輻射損傷問題是限制生物樣品分辨率進一步提高的主要因素。目前冷凍透射電子顯微鏡單顆粒成像技術已經被廣泛應用于單顆粒病毒等全同性樣品的三維高分辨成像。其利用樣品具有全同性的特點，通過大量測量樣品在實空間中的圖像，結合圖像處理方法對樣品透射電鏡圖像進行篩選和降噪處理，利用等價線和投影匹配的方法確定樣品的取向和中心以及實現各圖像之間的歸一化，對已處理電鏡照片進行二維傅里葉變換，從而實現大量病毒樣品衍射圖樣的三維重組，最后利用三維傅里葉逆變換實現病毒樣品的三維成像。該方法已經成功實現了多種病毒三維結構的解析，并且在全同蛋白顆粒三維結構解析中得到了廣泛的應用。但是冷凍電子顯微鏡在實現單顆粒三維成像過程中同樣需要拍攝大量的全同顆粒的實空間圖像，同時考慮到電子對生物樣品具有嚴重的輻射損傷，需要減少電子劑量，因此所獲得的透射電鏡照片襯度較低，圖像質量較差，需要對數據進行篩選和降噪音處理，使得數據處理變得繁瑣。

相比于電子，X射線對樣品的輻射損傷更小，但是對于病毒等生物單顆粒樣品來說，由于其對X射線的衍射能力較弱，很難獲取高質量的衍射信號，得到較高分辨率的重建圖像。為了進一步提高成像分辨率，需要增加相干X射線衍射成像技術的曝光時間，不僅對成像設備的穩定性有較高的要求，而且也容易因為長時間X射線輻照使樣品結構發生變化。目前相干X射線光源亮度的提高為解決該問題提供了光源基礎。X射線自由電子激光作為第四代同步輻射光源具有全相干、亮度高、短脈沖的特點，其脈沖時間可以達到飛秒，能夠在樣品破壞之前記錄下其衍射數據，成功的解決了樣品輻射損傷的問題，能夠對自然狀態下的樣品進行成像，是實現原位、動態成像的理想光源。X射線自由電子激光技術與相干X射線衍射成像技術相結合是目前研究的重點，其為實現單次測量對稱性微納米樣品實現三維重建的成像方法提供了可能，并在解析對稱性晶體結構和病毒結構以及非結晶性的全同顆粒結構，如多種細胞膜復合物，分子伴侶，核糖體等樣品三維結構中具有重要的應用價值。然而，經檢索以X射線自由電子激光為光源，單次照射對稱性微納米樣品實現樣品三維重建的方法還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種以X射線單次測量實現對稱性微納米樣品三維成像的方法。

本發明所述以X射線單次測量實現對稱性微納米樣品三維成像的方法，步驟包括：樣品制備，對稱性樣品二維衍射數據的獲取，單顆粒正入射二維衍射數據選取，單顆粒正入射衍射數據的處理，樣品的空間取向確定，樣品的三維衍射數據獲取，對三維衍射數據進行相位恢復和三維重建。具體是：

1）制備濃度適中的單分散性樣品：將具有對稱外形的納米晶體或病毒樣品進行純化處理，得到粒徑和形貌相同的全同樣品。

將純化之后的樣品進行稀釋，利用超聲或震蕩方式分散處理1～10分鐘，充分分散樣品，用移液器取樣品1-10μL滴至厚度為20～200nm的Si₃N₄薄膜上，并使膜表面上的樣品密度不高于0.1個/μm²，即制得單分散樣品。

上述具有對稱外形的納米晶體優選是四六面體納米晶，偏方三八面體納米晶，三八面體納米晶或六八面體納米晶；上述具有對稱外形的病毒優選二十面體病毒顆粒。