[發(fā)明專利]重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310479016.0
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103524628A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫非;梁重陽;張喜田
• 申請（專利權(quán)）人: 張喜田;孫非
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K38/16;A61K47/48;A61P35/00;A61P7/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組融合蛋白的構(gòu)建、表達、純化與應(yīng)用，具體涉及用于治療化療導(dǎo)致的白細胞較少癥和腫瘤等癥的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與人血清白蛋白融合蛋白的制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（LZ-8）源自于松杉靈芝的菌絲體，其結(jié)構(gòu)特征如下：包括一個N端的形成二聚體所需的重要結(jié)構(gòu)域和一個C端的FNIII結(jié)構(gòu)域，rLZ-8的N-端結(jié)構(gòu)域由一個α-helix和一個β-strand組成，LZ-8單體上的N端α-helix和β-strand與另一單體上相同的結(jié)構(gòu)域通過空間交換形成了重要的二聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，呈啞鈴狀。已有文獻報道LZ-8具有免疫調(diào)節(jié)（專利申請?zhí)?01110222012.5）和殺傷腫瘤細胞（專利ZL200810050206.X）的生物學(xué)活性。

目前，造成蛋白類藥物半衰期較短的原因主要有：①蛋白質(zhì)水解是絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的代謝方式之一，機體組織中蛋白水解酶的存在會使蛋白質(zhì)藥物活性降低；②腎臟是小分子蛋白質(zhì)分解代謝過程中最重要的器官，相對分子質(zhì)量小于69000Da的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)分子都能通過腎小球濾過作用而被排出體外；③肝臟在蛋白質(zhì)藥物代謝過程中也具有重要作用，藥物通過擴散和載體轉(zhuǎn)運等形式被轉(zhuǎn)運至肝細胞中，然后再被微粒體酶P450、胞液中的蛋白酶或溶酶體所降解；而對于更大分子的肽和蛋白質(zhì)則是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被肝細胞攝取后被降解。由于靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白二聚體分子量不足26kDa，可能造成體內(nèi)清除率高，藥代動力學(xué)參數(shù)難以滿足其新藥開發(fā)的要求，因此，通過基因水平融合等技術(shù)手段延長LZ-8在體內(nèi)的作用時間，為其在臨床治療中的應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。為了延長蛋白類藥物的半衰期，近幾年各國學(xué)者主要從蛋白類藥物的白蛋白融合、化學(xué)修飾、微囊化、構(gòu)建突變體、糖基化等方面進行研究。隨著研究的不斷深入和進展，長效蛋白藥物的新品種不斷涌現(xiàn)。

基因融合技術(shù)是將不同的基因連接起來從而表達具有復(fù)合功能的融合蛋白，通過基因融合技術(shù)增加多肽和蛋白藥物分子量或改變藥物與受體的親和性等原理可以延長藥物的半衰期。構(gòu)建融合蛋白的原則為：將一個蛋白的編碼基因的終止密碼子去除，然后連接上帶有終止密碼子的另一個蛋白的編碼基因，即實現(xiàn)兩種蛋白的編碼基因的融合，進而同時表達兩種蛋白。融合蛋白基因穩(wěn)定性高，可調(diào)控表達且制備簡單，產(chǎn)物均一，對蛋白、多肽藥物活性影響小等是目前研究長效多肽、蛋白藥物的一種良好的途徑。

目前研究的較為廣泛的融合基因有人血清白蛋白基因、人免疫球蛋白（IgG1、IgG4）基因等。人血清白蛋白（Human?Serum?Albumin，簡稱HSA）是人血漿中的蛋白質(zhì)，其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸，分子量為66kDa。在血漿中其濃度為42g/L，約占血漿總蛋白的60%。在體液中人血清白蛋白可以運輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等；同時維持血液正常的滲透壓。在臨床上人血清白蛋白可用于治療休克與燒傷，用于補充因手術(shù)、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑。

人免疫球蛋白（IgG）是人體血液中最豐富的蛋白，其半衰期可達21天。已有報道顯示將IgG的Fc片段與其他蛋白融合，可顯著增加其他蛋白在體內(nèi)的生物活性和半衰期，其中大多數(shù)實驗者選擇IgG1、IgG4這兩種亞型的Fc段作為融合對象，這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于一些臨床上很重要的細胞因子和可溶性受體，如sTNF-αR、LFA3、CTLA-4、IL-2、IFN-α等，并獲得了成功。

????鑒于上述背景技術(shù)，本發(fā)明采用了基因重組技術(shù)將靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白分別與人血清白蛋白、人免疫球蛋白IgG的Fc段進行融合，構(gòu)建真核表達體系，經(jīng)過表達、純化得到目的蛋白，并對目的蛋白進行了相關(guān)生物學(xué)活性與藥學(xué)研究，結(jié)果表明靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（LZ-8）與HSA融合蛋白在藥學(xué)與生物學(xué)活性以及病理應(yīng)用方面有明顯差異。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法，探討其在治療化療藥所致白細胞減少癥等癥及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。