[發(fā)明專利]一種中華絨螯蟹性早熟個(gè)體活體分子檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310478940.7
• 申請(qǐng)日: 2013-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN103555727A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈懷舜;周鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/10;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌;曹翠珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種中華絨螯蟹EsEcR基因克隆方法及以EsEcR基因?yàn)榛A(chǔ)的中華絨螯蟹性早熟個(gè)體的活體分子檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

中華絨螯蟹(Eriocheir?sinensis)屬節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼綱，十足目，爬行亞目，短尾族，方蟹科，弓腿亞科，絨螫蟹屬，俗稱河蟹，廣泛分布于我國(guó)東南部沿海的咸淡水或淡水水域中，其肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，河蟹是中國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的淡水蟹類。作為一種甲殼動(dòng)物，河蟹的生長(zhǎng)是通過蛻皮形式體現(xiàn)的。蛻皮即蛻去舊的外骨骼并長(zhǎng)出新的外骨骼的過程，是甲殼動(dòng)物最顯著的生理特征。河蟹性成熟對(duì)脫殼有抑制作用，也就不再生長(zhǎng)，脫殼次數(shù)直接決定了河蟹個(gè)體的規(guī)格，大規(guī)格河蟹的經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于小規(guī)格河蟹，但目前在河蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)中，普遍存在著有20%-30%的河蟹性早熟現(xiàn)象，早熟河蟹個(gè)體很小，性腺已經(jīng)成熟不再脫殼，也即不再生長(zhǎng)，商品價(jià)值極低。性腺成熟程度可以通過性腺成熟指數(shù)（gonadosomatic?index，GSI）直觀反應(yīng)，要獲得性腺指數(shù)必須通過解剖稱重性腺，無(wú)法活體檢測(cè)。

蛻皮激素受體(ecdysteroid?receptor，ECR)是動(dòng)物核受體(nuclear?receptor)超家族成員之一，主要在無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。RXR具有重要的生物學(xué)功能，與維甲酸X受體（RXR,retinoid?x?receptor)作用形成異源二聚體，蛻皮激素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與之結(jié)合形成有功能的形式從而調(diào)控下游一系列蛻皮相關(guān)的基因的表達(dá)，最終觸發(fā)動(dòng)物的蛻皮反應(yīng)。RXR-ECR異源二聚體是甲殼類等蛻皮分子信號(hào)途徑必不可少的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

目前，有幾種蝦蟹類EcR基因已被克隆，包括：Marsupenaeus?japonicas、Fenneropenaeus?chinensis、Crangon?crangon等，而中華絨螯蟹的EcR基因（這里命名為：EsEcR）還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種中華絨螯蟹性早熟個(gè)體活體分子檢測(cè)方法。

我們利用RACE(rapid-amplification?of?cDNA?ends)克隆技術(shù)克隆了中華絨螯蟹的EcR基因全長(zhǎng)cDNA，通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)性早熟個(gè)體中EcR基因的表達(dá)量顯著低于正常個(gè)體，只有正常個(gè)體表達(dá)量的27%（p＜0.001），該結(jié)果可應(yīng)用于河蟹性早熟個(gè)體的活體分子檢測(cè)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的：

一種中華絨螯蟹EsEcR基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。

一種用于PCR擴(kuò)增以上所述的中華絨螯蟹EsEcR基因的引物組，由如下引物組成：

3′正向外引物3aEsEcR-F1：序列如SEQ?ID?NO.3所示；

3′正向內(nèi)引物3aEsEcR-F2：序列如SEQ?ID?NO.4所示；

5′反向外引物5aEsEcR-R1：序列如SEQ?ID?NO.5所示；

5′反向內(nèi)引物5aEsEcR-R2：序列如SEQ?ID?NO.6所示。

一種擴(kuò)增以上所述的中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：獲得中華絨螯蟹組織的總RNA；

步驟2：從GenBank中華絨螯蟹核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到一個(gè)EcR基因同源序列，作為中間序列，以此序列作為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增EsECR基因的3’和5’端片段的特異性引物組；

步驟3：以步驟1所得總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別以SEQ?NO.3和4所示的引物、和SEQ?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示的引物對(duì)模板的3’端和5’端進(jìn)行巢式兩輪PCR擴(kuò)增，得到中華絨螯蟹EsEcR基因的3′和5′端片段；

步驟4：將步驟2中所述中間序列、步驟3中所述中華絨螯蟹EsEcR基因的3′和5′端片段拼接，即得擴(kuò)增后的中華絨螯蟹EsEcR基因。

以上所述的擴(kuò)增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端進(jìn)行巢式兩輪PCR擴(kuò)增的3’端第一輪PCR擴(kuò)增的條件為94℃，3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，20個(gè)循環(huán)；72℃，10min；4℃保存。

以上所述的擴(kuò)增中華絨螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端進(jìn)行巢式兩輪PCR擴(kuò)增的3’端第二輪PCR擴(kuò)增的條件為94℃，3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃，10min。