[發明專利]檢測結直腸癌及其惡性程度的免疫組化試劑盒

無效

• 申請號: 201310478845.7
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103499694A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 沈守榮;馬健;張學梅;李夏雨;李楠;唐岸柳
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 中南大學專利中心 43200
• 代理人: 胡奕

技術領域

本發明涉及結直腸腫瘤免疫診斷試劑盒，尤其涉及用于診斷結直腸腫瘤及判斷其惡性程度的免疫組化試劑盒。

背景技術

?S100蛋白是由小分子量蛋白（10-14?kDa）組成的鈣結合蛋白家族，因其在中性?pH?條件下能溶解于?100%?飽和度硫酸銨中而得名。研究發現，此類蛋白僅在脊柱動物中表達，目前已發現23種S100?蛋白家族成員。S100A9蛋白是S100?蛋白家族的重要成員，具有S100?蛋白家族特征性的保守EF?手型結構和4-螺旋環形，與Ca²⁺、Zn²⁺及Cu²⁺等不同金屬離子結合發生結構變異，暴露與靶蛋白的結合位點進而通過與相應的效應靶蛋白相互作用參與系列反應。其主要在粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞中高表達，通常與S100A8蛋白共表達形成異二聚體—S100A8/9鈣衛蛋白，結合TLR4、RAGE、CD36和細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（EMMPRIN）等受體后激活NF-κB、AP-1及其他轉錄因子，參與急慢性炎癥反應、免疫調節、腫瘤生長、增殖及侵襲轉等系列生物學效應。國內外目前雖有研究表明S100A9與腫瘤相關，但對于S100A9與特定類型腫瘤細胞發生發展的關系，以及其應用于特定類型腫瘤的診斷與治療，尚缺少研究。

結直腸癌（colorectal?cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤，據2008年國際癌癥機構（IARC）研究統計，世界范圍內每年約有一百萬人發生結直腸癌，全球結直腸癌死亡率占腫瘤總死亡率8%，腫瘤致死率排名第四，且我國結直腸癌病死率高達45.5%，而結直腸腫瘤的惡性程度與腫瘤致死率密切相關。因此，尋找一種對結直腸癌進行診斷并對其惡性程度進行判斷的方法至關重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種結直腸癌診斷及惡性程度判斷的S100A9免疫組化檢測試劑盒，通過該試劑盒可以方便快捷地檢測樣本結直腸病理組織表面S100A9抗原的表達水平，從而可以為結直腸癌診斷及其惡性程度的判斷提供幫助。

為達到上述發明目的，本發明提供的診斷試劑盒包含：內源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性結合位點阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑；其中一抗為人源抗S100A9?單克隆抗體或鼠源抗S100A9?單克隆抗體，二抗為生物素標記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。

本發明中，常規各種用于免疫組化試驗的內源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性結合位點阻斷劑、酶、顯色劑均可用于本發明試驗盒，但作為最佳選擇，內源性過氧化物酶阻斷劑為3wt%?H₂O₂；非特異性結合位點阻斷劑為動物非免疫血清，其中優選非免疫羊血清；酶優選鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶；顯色劑優選DAB顯色劑，包括：DAB緩沖液（20×），DAB底物（20×），DAB色原（20×）。

更進一步地，作為本發明試劑盒的優化，還可以在試劑盒中設置用于參照的比對色卡，以方便對待測樣本的染色結果進行比對，或者設置對待測樣本切片中染色細胞百分數進行計算的計數器，以便于對樣本染色結果做快速分析。

?發明人通過研究發現：S100A9在結直腸癌中的表達水平明顯高于正常結直腸組織，并且，S100A9蛋白的表達水平在不同分化程度結直腸癌組織中表達強度存在顯著差別，高、中、低分化結直腸癌組織中，S100A9蛋白表達的強陽性率呈明顯遞增趨勢，即分化程度越低，強陽性表達水平越高，分化程度越高，表達水平越低。因此，檢測受試者結直腸組織表面S100A9的表達水平，可以作為結直腸癌的惡性程度診斷的分子標志物。因此，發明人提供上述免疫組化試劑盒，利用該試劑盒，通過檢測結直腸病理組織表面S100A9抗原的表達，能快速準確地判斷結直腸癌惡性程度的臨床診斷提供幫助。試劑盒中設置比對色卡和染色細胞計數器，能方便對染色結果做快速準確地分析，提高試劑盒的易用性和方便性。

附圖說明

圖1：NCBI?GEO?DataSets系列GSE37364中探針203535_at所對應的S100A9在38例正常結直腸組織和27例結直腸癌組織的RNA表達結果圖。

圖2：免疫組化檢測正常結直腸組織及高、低分化結直腸癌組織中S100A9蛋白的表達結果圖A-E圖均為顯微鏡下放大200倍的組織結構圖，其中：

A：正常結直腸組織陰性對照（未加S100A9一抗）；

B：結直腸癌組織陰性對照（未加S100A9一抗）；

C：正常結直腸組織；

D：高分化結直腸癌組織；