[發(fā)明專利]腐蝕穩(wěn)定性色譜分析用配體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310478275.1
• 申請日: 2009-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN103601794A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: N·卞;N·索伊斯;S·斯佩克特;K·萊文
• 申請（專利權(quán)）人: EMD密理博公司
• 主分類號(hào): C07K14/31
• 分類號(hào): C07K14/31;C07K1/22;B01D15/38;G01N33/68
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 過曉東

本申請是申請日為2009年12月23日的第200911000241.1號(hào)發(fā)明名稱為“腐蝕穩(wěn)定性色譜分析用配體”的中國專利申請的分案申請。

相關(guān)申請

本申請要求申請?zhí)枮镹o.61/203,664，申請日為2008年12月24日的美國臨時(shí)專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此全部并入本申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有提高的腐蝕穩(wěn)定性的色譜分析用配體，例如，基于免疫球蛋白結(jié)合蛋白(如，葡萄球菌A蛋白)的配體，以及包含此類配體的色譜分析基質(zhì)。

背景技術(shù)

在親和色譜分析中使用的配體通常賦予對靶分子的高選擇性，因此導(dǎo)致了對靶分子的高收率以及快速而經(jīng)濟(jì)的純化。基于葡萄球菌A蛋白（SpA）的試劑以及色譜分析基質(zhì)達(dá)到了在捕獲和純化抗體的親和色譜分析中的廣泛應(yīng)用，并且由于其結(jié)合IgG而對免疫球蛋白和抗體的親和性沒有顯著影響的能力，其同樣廣泛應(yīng)用于抗體檢測方法。

據(jù)此，已經(jīng)開發(fā)了多種包含A蛋白－配體的試劑以及介質(zhì)，并且在商業(yè)上可獲得，包括，例如，－vA?High?Capacity，vA?Ultra和UltraPlus（Millipore）及Protein?A?Sepharose^TM，MabSelect^TM，MabSelect?Xtra^TM和MabSelect（GE?Healthcare）和Poros?MabCapture?A^TM（Applied?Biosystems）。

為了維持色譜分析用配體(所述配體包括，如，包含基于SpA的色譜分析用配體的樹脂)的選擇性和結(jié)合能力，需要對配體結(jié)合樹脂(稱作色譜分析基質(zhì))進(jìn)行清潔，并且通常在堿性條件下清洗，如，使用氫氧化鈉。舉例來說，用于清洗和復(fù)原基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)過程是一種原位清洗（Cleaning-in-place，CIP）的堿性方案，一般包括使用pH14的1M?NaOH對基質(zhì)進(jìn)行處理。但是，這種不太溫和的處理經(jīng)常是不期望的，當(dāng)配體是一種蛋白或是基于蛋白的分子時(shí)尤其如此。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了具有堿穩(wěn)定性的基于SpA的色譜分析用配體，例如，其能夠耐受重復(fù)的原位清洗（CIP）循環(huán)。更特別的是，基于本發(fā)明的配體可以在延長的時(shí)間中耐受傳統(tǒng)的堿性清洗，這使得所述配體成為引人注目的候選物，特別是對于免疫球蛋白進(jìn)行低成本高效率且高水平的純化而言尤為如此。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，堿穩(wěn)定性色譜分析用配體包含兩個(gè)或更多個(gè)SpA結(jié)構(gòu)域。例如，在這方面的一些實(shí)施方式中，提供了堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，所述配體包含兩個(gè)或更多個(gè)葡萄球菌A蛋白（SpA）或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域，所述兩個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于一個(gè)位點(diǎn)。

在基于該方面的一些實(shí)施方式中，所述配體包含三個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者三個(gè)或更多個(gè)SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域，所述三個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或者三個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于一個(gè)位點(diǎn)。在另一些實(shí)施方式中，所述配體包含四個(gè)或更多個(gè)SpA?B結(jié)構(gòu)域或者四個(gè)或更多個(gè)SpA?Z結(jié)構(gòu)域，所述四個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或四個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于一個(gè)位點(diǎn)。在其它實(shí)施方式中，所述配體包含五個(gè)或更多個(gè)SpA?B結(jié)構(gòu)域或五個(gè)或更多個(gè)SpA?Z結(jié)構(gòu)域；或包含六個(gè)或更多個(gè)SpA?B結(jié)構(gòu)域或六個(gè)或更多個(gè)SpA?Z結(jié)構(gòu)域；或包含七個(gè)或更多個(gè)SpA?B結(jié)構(gòu)域或七個(gè)或更多個(gè)SpA?Z結(jié)構(gòu)域，所述五個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或五個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域，六個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或六個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域，七個(gè)或更多個(gè)B結(jié)構(gòu)域或七個(gè)或更多個(gè)Z結(jié)構(gòu)域，被附著在色譜分析樹脂上，附著位點(diǎn)為樹脂上的多于一個(gè)位點(diǎn)。

基于本發(fā)明的另一方面，堿穩(wěn)定性色譜分析用配體包含一個(gè)或多個(gè)分離的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，所述一個(gè)或多個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域包含位于n＋1位的一個(gè)或多個(gè)突變?yōu)槌腚装彼幔–）、絲氨酸（S）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、天冬酰胺（N）、或谷氨酰胺（Q）之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，n代表分離的SpA結(jié)構(gòu)域的23位天冬酰胺殘基。在分離的SpA結(jié)構(gòu)域的24位具有突變的示例性配體如表1所示，其中n代表天冬酰胺。