[發明專利]用ISSR分子標記法對甘薯品種真實性進行鑒別的方法

有效

• 申請號: 201310478265.8
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103484555A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 楊新筍;王連軍;蘇文瑾;雷劍;柴沙沙
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院糧食作物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種用ISSR分子標記法對甘薯品種真實性進行鑒別的方法。

背景技術

甘薯是一種重要的糧食、飼料、工業原料和能源作物。近些年，隨著全球石油供給形勢的日益嚴重，生物質能源的開發和利用日益重要。甘薯單位面積淀粉產量高，被認為是生產燃料乙醇的理想原料。甘薯作為新型的能源用植物，其市場潛力巨大，它將在我國能源安全中扮演重要的角色。

甘薯種薯的真實性和純度是衡量種薯質量的重要指標，直接影響甘薯的產量和品質。生產上如何快速、準確鑒定甘薯種薯真實性是一個突出的問題。傳統的形態鑒定法依賴于品種表型差異，而形態性狀的表現受環境影響較大，穩定性差，誤鑒率較高。

分子標記技術具有豐富的多態性和環境穩定性，且操作簡便，已開始廣泛應用于作物品種鑒定與純度檢測中。ISSR分子標記是在SSR標記基礎上發展起來的一種新技術,其基本原理是在SSR的5’或3’端加錨1-4個嘌呤或嘧啶堿基，然后以此為引物，對兩側具有反向排列SSR的一段基因組DNA序列進行擴增。ISSR兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的優點，與SSR相比，ISSR不需要預先獲知序列信息而使成本降低，且多態性更豐富；與RAPD相比，ISSR重復性高，穩定性好，同時具備RAPD的簡便、易操作等特點。目前，ISSR標記技術在植物種質資源遺傳多樣性和親緣關系、基因定位、分子標記輔助選擇等研究中已廣泛的應用。在甘薯中，應用ISSR分子標記分析甘薯種質資源遺傳多樣性已有報道，但應用ISSR分子標記技術進行甘薯品種真實性鑒定的方法尚未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種用ISSR分子標記法對甘薯品種真實性進行快速鑒別的方法。

本發明提供的一種用于輔助鑒定甘薯種薯真實性的引物組，由HBAAS-001引物、HBAAS-815引物和HBAAS-825引物組成；

HBAAS-001引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；

HBAAS-815引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；

HBAAS-825引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

一種用于輔助鑒定甘薯種薯真實性的試劑盒也屬于本發明的保護范圍，該試劑盒由上述引物組、PCR擴增緩沖液，dNTP，DNA聚合酶和ddH₂O組成。

一種指紋圖譜也屬于本發明的保護范圍，分別以所述引物組的三條引物對16種甘薯品種的葉片的DNA分別進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，得到每條引物針對每個甘薯品種的譜帶，即為所述引物HBAAS-001對16種甘薯品種構建的指紋圖譜、引物HBAAS-815對16種甘薯品種構建的指紋圖譜和引物HBAAS-825對16種甘薯品種構建的指紋圖譜；

所述16種甘薯品種為廣薯菜2號、商薯19、尚志12、徐紫薯1號、魯薯3號、徐薯26、徐薯43-14、蘇薯10號、蘇薯3號、蘇薯11號、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、臺農71、徐22-5和臺農66；

所述PCR的體系如下：

模板DNA1μL，濃度為10μM的引物2μL，10×PCR擴增緩沖液5μL，濃度為2.5mM的dNTPs4μL，DNA聚合酶0.5μL，dd?H₂O補充體系至50μL；

DNA聚合酶的商品名稱為Easy?Taq?DNA?Polymerase，購自北京全式金生物技術有限公司，產品目錄號為AP111；

所述模板DNA為下述16種甘薯品種的葉片的DNA：廣薯菜2號、商薯19、尚志12、徐紫薯1號、魯薯3號、徐薯26、徐薯43-14、蘇薯10號、蘇薯3號、蘇薯11號、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、臺農71、徐22-5和臺農66；

所述引物分別為所述引物組的三種引物；

所述PCR的程序如下：

94℃變性5min；94℃變性30s，60℃復性1min，72℃延伸3min，共40個循環；72℃延伸10min，10℃保存；

所述16種甘薯品種為廣薯菜2號、商薯19、尚志12、徐紫薯1號、魯薯3號、徐薯26、徐薯43-14、蘇薯10號、蘇薯3號、蘇薯11號、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、臺農71、徐22-5和臺農66；

所述瓊脂糖凝膠的濃度為4%，瓊脂糖與電泳緩沖液的比例為4g：100ml。