[發明專利]一種提高阿尼芬凈前體化合物Echinocandin B產量的方法

有效

• 申請號: 201310478251.6
• 申請日: 2013-10-12
• 公開（公告）號: CN103509840A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 鄭裕國;牛坤;鄒樹平;毛健;鐘偉;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P21/04
• 分類號: C12P21/04;C12R1/66
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種提高阿尼芬凈前體化合物Echinocandin?B產量的培養方法。?

（二）背景技術

近年來，器官移植手術導致免疫抑制劑的大量使用，化療和更具有侵襲性的醫療方法的應用等多種原因造成免疫低下患者增多，真菌感染發病率顯著升高，尤其是深部真菌感染的發病率和病死率逐年增加。據世界衛生組織（WHO）2004年的統計估計，全球每年的系統性真菌感染人數為33.5萬。其中最常見的是系統性念珠菌病，約占所有此類感染的70%左右，而其引起的死亡率又高達40%左右。隨著醫學的不斷進步，20世紀90年代后，各種抗真菌藥物不斷問世，為治療各類真菌疾病帶來革命性的進步。由于對抗真菌藥物的需求逐年攀升，使得其市場規模越加旺盛。?

棘白菌素（Echinocandin）類抗生素是20世紀70年代發現的一組天然產物，具有類似的環狀多肽核心和不同的脂肪酸側鏈的結構特征，能夠非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，從而達到抗真菌的目的。其中阿尼芬凈（Anidulafungin）是繼卡泊芬凈（Caspofungin）、米卡芬凈（Micafungin）之后的第三代全身抗真菌類棘白菌素衍生物藥物，2006年2月21日，由輝瑞公司生產的阿尼芬凈通過了美國FDA認證，主要治療念珠菌血癥和其他形式的念珠菌感染（腹腔膿腫、腹膜炎）和食管念珠菌等。阿尼芬凈是由前體化合物Echinocandin?B（ECB）經猶他游動放線菌產生的酰化酶作用脫去側鏈亞油酰基，然后在DMF中與活性中間體?4-戊氧基-[1,1',4',1]三苯基-4-甲酸-2,4,5-三氯-苯基酯反應制得。阿尼芬凈與ECB的化學結構式如式1、2所示。?

根據文獻和專利報道，目前國內外ECB均是利用微生物發酵法進行制備，其中主要為構巢曲霉（Aspergillus?nidulans）的發酵。Maria?Papagianni等人綜述了發酵過程中的接種量、碳氮源種類及濃度、pH、溫度及攪拌速率等因素對構巢曲霉生長的影響，表明中性pH有利于菌體生長和孢子形成，且其比生長速率會隨溫度的升高而升高，但是溫度升高后菌體出現失水加劇的后果，最終會導致目標化合物的合成量降低。ECB是合成阿尼芬凈的主要前體化合物，其發酵單位的高低將直接影響阿尼芬凈的市場前景。Fritz?Benz等學者通過紅外、核磁共振等方法確定了ECB的分子結構，且發現其水解成分中包括了亞油酸、4-羥基-L-脯氨酸、4-羰基-L-脯氨酸、L-蘇氨酸、(2S,3S,4S)-4-甲基-3-羥脯氨酸等，并且發酵培養基中添加碳酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及硝酸鹽等組分對ECB產量的提高均有促進作用。?

目前關于ECB發酵的文獻報道較少，相關文獻大多集中于卡泊芬凈及米卡芬凈的前體化合物發酵。美國學者在研究卡泊芬凈的前體化合物Pneumocandin?B₀發酵時，發現適當增加鎂離子濃度可以刺激菌體的生長，但是鎂離子濃度的增加又會降低前體化合物的合成，相反硫酸銨和磷酸二氫鉀對該前體物質的產量具有促進作用。Petersen等人考察了脯氨酸的添?加對Pneumocandin?B₀的影響，發現當培養基中不添加脯氨酸時，其效價僅為274mg/L，當添加10g/L脯氨酸后其效價提高至494mg/L；國內劉靚等人也發現在培養基中添加3g/L的脯氨酸能夠有效地提高Pneumocandin?B₀在發酵產物中的比例。?

除了氨基酸之外，Petersen等人還考察了二價金屬離子對Pneumocandin?B₀效價的影響，發現添加36μM?Zn²⁺使B₀的效價由629mg/L降低至312mg/L；而添加36μM?Co²⁺和Ni²⁺分別使B₀的效價降低了33%和15%；Cu²⁺則對發酵產物的影響較小，分析表明效價的降低是由于金屬離子對Pneumocandin?B₀合成過程中的相關酶α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶的活性產生抑制引起的。Munekazu?Kanda等人在發酵生產米卡芬凈前體時優化了發酵培養基，發現硫酸鎂的添加量高于0.2%，磷酸鹽濃度為0.5%時，其關鍵酶的酶活由12U/ml提高至16U/ml，提高了30%。?