[發明專利]黃曲霉特異性單鏈抗體的制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310477107.0
• 申請日: 2013-10-13
• 公開（公告）號: CN103555732A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 廖玉才;薛升;李和平
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C07K16/14;C12N15/62;C07K19/00;C12N5/20;C12P21/08;G01N33/68;C12Q1/04;C12R1/91
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于食品有害微生物分子檢測技術領域，具體涉及一種黃曲霉特異單鏈抗體和單克隆抗體的制備方法及其在黃曲霉免疫學檢測中的應用。?

背景技術

黃曲霉(Aspergillus?flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是廣泛分布的產生黃曲霉毒素的絲狀真菌，可以侵染花生(Arachis?hypogaeaL.)、玉米(Zea?maysL.)、棉花(Gossypium?spp.)等引起多種作物的病害，危害糧食和經濟作物的生產，造成嚴重的經濟損失。在糧食儲藏以及食品和飼料的加工、運輸等環節也及易發生黃曲霉和寄生曲霉的污染，導致黃曲霉毒素的積累，從而嚴重威脅人畜健康及食品安全。黃曲霉毒素主要有AFB_l，AFB₂，AFG_l，AFG₂四種類型，主要由黃曲霉和寄生曲霉產生，在我國華南、華中、華北地區產毒菌株分布較廣。黃曲霉毒素是真菌生長過程中的次級代謝產物，具有強烈的急性毒性和強烈的致癌、致畸作應，被國際癌癥研究機構(IARC)認定為I類致癌物。此外，黃曲霉菌是僅次于煙曲霉(A.fumigatus)的可引起人畜侵襲性曲霉病的第二大類病原菌，嚴重危害人畜健康。黃曲霉毒素非常穩定，高溫(200℃)處理、紫外照射都不能使其分解，一旦發生污染很難進行除去。因此，快速有效的對黃曲霉、寄生曲霉檢測方法對于監測農作物病害發生、從源頭上控制黃曲霉毒素的污染具有重要意義。本發明選用的抗原制備菌株是高產毒的黃曲霉菌株。?

目前對黃曲霉、寄生曲霉的監測方法主要是傳統生物學方法(如：傳統培養基法)、分子檢測(如：PCR)、免疫學檢測(如：ELISA)。傳統培養基法耗時太長，PCR分子檢測方法需要特殊的儀器和器材，需專門提取樣品的DNA，樣品前處理步驟繁瑣，操作人員需要具備專門技能。此外，這些傳統檢測方法的現場實時監測及檢測方法的微型化都受到限制。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測具有較高的特異性和靈敏度，樣品不需要復雜的前處理，便于微型化操作和進行現場實時監測，不受儀器設備和專業操作人員的限制。ELISA檢測中常用的酶標二抗為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)標記的抗體，一般通過化學交聯的方法將催化酶標記到抗體上。具有隨機反應特點的化學交聯過程所產生的交聯位點可能會影響抗體與抗原的結合，導致抗體特異性和親和力下降，對交聯反應的優化和酶標抗體的質量檢測也會導致生產成本的提高。利用生物技術得到的單鏈抗體(scFv)具有單克隆抗體的同質性的特點并且基因編碼序列明確，同時可以通過微生物發酵進行大量生產。此外，還可以通過基因工程手段對單鏈抗體進行改造，可以得到抗體和酶的融合蛋白，這種同時具有抗原識別能力和酶催化活性的雙功能蛋白可以極大促進ELISA檢測方法的應用。本發明通過免疫雞，在克隆雞的抗體基因基礎上構建了單鏈抗體噬菌體展示文庫，利用噬菌體展示方法對文庫進行了篩選之后得到了可以識別黃曲霉和寄生曲霉的單鏈抗體基因。通過免疫小鼠制備了一株可分泌黃曲霉特異單克隆抗體的雜交瘤細胞株。通過對單鏈抗體基因進行基因工程改造得到了scFv-AP融合蛋白并在大腸桿菌中進行大量表達。該scFv-AP融合蛋白可以與黃曲霉特異單克隆抗體配套使用在雙抗體夾心ELISA檢測當中。該檢測方法靈敏度高，不需要額外的酶標二抗操作簡便迅速，可以應用于農作物種植、糧食儲藏、食品和飼料加工等領域中的對黃曲霉和寄生曲霉污染的檢測。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，其目的之一在于提供一種黃曲霉特異單鏈抗體基因，該基因利用噬菌體展示技術從免疫后的雞源單鏈抗體文庫中獲得，申請人將該基因命名為AfSA4，其核苷酸序列如SEQ?IDNO：1所示(長度為756bp)，其編碼的蛋白質的氨基酸的序列如序列表SEQ?IDNO：2所示。本發明的黃曲霉特異單鏈抗體基因由輕鏈可變區和重鏈可變區組成，輕鏈可變區V_L由312個核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQ?IDNO：3所示(長度為390bp)；重鏈可變區V_II由390個核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQ?IDNO：5所示(長度為312bp)。?

本發明的目的之二在于提供了一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白，其蛋白質的序列如SEQ?IDNO：2所示，其輕鏈可變區V_L由104個氨基酸編碼，序列如SEQ?ID?NO：4所示；重鏈可變區V_II由130個氨基酸編碼，其序列如SEQ?ID?NO：6所示，輕鏈可變區和重鏈可變區由連接肽(GGSSRSSSSGGGGSGGGG)連接。?