[發(fā)明專利]一種促進(jìn)米斛原球莖芽發(fā)生的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310476857.6
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103493737A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅建平;潘利華;趙宏偉
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 合肥金安專利事務(wù)所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)米斛原球莖芽發(fā)生的方法。

技術(shù)背景

米斛是霍山石斛的俗稱，是我國特有的一種傳統(tǒng)而名貴的中草藥。趙學(xué)敏在他所著的《本草綱目拾遺》中引用范瑤初云：“霍山屬六安州，其地所產(chǎn)石斛，名米心石斛。以其形如累米，多節(jié)，類竹鞭，干之成團(tuán)，他產(chǎn)者不能米心，亦不成團(tuán)也。”《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載米斛具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、清音明目功效。現(xiàn)代藥理研究表明，米斛含有多糖等功能因子，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、白內(nèi)障等生理功能。因此，米斛倍受藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域的青睞，目前市場價格為400元/克左右，因而又有軟黃金的美稱。

米斛生長在懸崖峭壁崖的石縫隙間和參天古樹上，生長極其緩慢，自身繁殖能力低下，加之藥農(nóng)的過度采集和生態(tài)環(huán)境的日趨惡化，野生米斛資源極其匱乏。為保護(hù)米斛野生種質(zhì)資源、可持續(xù)利用米斛資源，人們加強(qiáng)了米斛的組織培養(yǎng)和人工繁殖研究，取得了一定的突破。比如，公開號為CN102835317A的發(fā)明提供了一種硒化霍山石斛培養(yǎng)物（即富硒的米斛愈傷組織）及其生產(chǎn)方法，公開號為CN102246697A的發(fā)明提供了一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法，公開號為CN102283120A的發(fā)明提供了一種霍山石斛種苗繁殖方法，這些發(fā)明都是首先通過米斛的成熟果實誘導(dǎo)獲得無菌試管苗，再通過無菌試管苗誘導(dǎo)獲取體細(xì)胞胚，或者通過體細(xì)胞胚進(jìn)一步分化成種苗或植株。這些方法存在以下不足：（1）無菌試管苗的誘導(dǎo)至少需要6個月，不僅生產(chǎn)周期長，而且要求果實里的種胚成熟度高；（2）體細(xì)胞胚進(jìn)一步分化成種苗或植株時添加了外源激素，這使米斛存在外源激素殘留的隱患。可見，如何安全、高效地進(jìn)行進(jìn)行米斛的人工繁殖仍是限制可持續(xù)利用米斛資源的瓶頸。

低溫是自然環(huán)境中種胚萌動、胚芽萌發(fā)的重要誘導(dǎo)子之一。低溫刺激會引發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，包括合成赤霉素、細(xì)胞生長素、細(xì)胞分裂素等內(nèi)源性激素，這些內(nèi)源性植物激素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中α-淀粉酶、果膠甲酯酶等酶的合成和運(yùn)輸，從而打破細(xì)胞只增殖不分化的生長狀態(tài)，促進(jìn)種胚的萌發(fā)，提高種胚的萌發(fā)能力。L-鳥氨酸是存在于生物體多種組織和細(xì)胞中的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有誘導(dǎo)內(nèi)源性生長激素分泌，促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及糖與脂肪的分解代謝、提高免疫功能、抗癌等生物活性，在生物體的生長代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用。在歐洲，L-鳥氨酸已作為膳食藥物銷售，日本則將L-鳥氨酸作為食品調(diào)料看待。植物種胚是植物繁殖的起始器官。一個種胚在適宜條件下萌動、膨大，形成一個原球莖；原球莖在人工控制條件下增殖，獲得的增殖物叫類原球莖，一個原球莖增殖擴(kuò)培后可以得到許多類原球莖；類原球莖具有細(xì)胞全能性，在適宜條件下既可以分化為植株，也可以萌發(fā)長出芽體，因為這芽體來源于種胚，所以稱之胚芽或原球莖芽。植物胚芽不僅含有比植株更高的功能營養(yǎng)，如豌豆芽能降血糖、大麥芽能治消化不良，而且可以發(fā)育成完整植株。可見，通過低溫、L-鳥氨酸等誘導(dǎo)子的應(yīng)用，將為瀕危植物資源的保護(hù)與利用提供新途徑，這方面的技術(shù)目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有米斛資源難以滿足市場需要，人工栽培中存在種苗缺乏、種苗誘導(dǎo)需要外源激素，種苗誘導(dǎo)時間長等問題。

本發(fā)明首先通過低溫誘導(dǎo)子聯(lián)合弱光誘導(dǎo)米斛種胚萌動形成米斛原球莖，再通過光照聯(lián)合L-鳥氨酸誘導(dǎo)米斛原球莖增殖形成大量的米斛類原球莖，然后通過低溫聯(lián)合L-鳥氨酸誘導(dǎo)米斛類原球莖萌芽形成米斛原球莖芽，實現(xiàn)米斛原球莖芽的發(fā)生，不僅可以為米斛類藥品及保健品的研發(fā)提供生料，而且可以為米斛的人工栽培生產(chǎn)提供種苗資源。

一種促進(jìn)米斛原球莖芽發(fā)生的方法的具體操作步驟如下：

（1）米斛原球莖的誘導(dǎo)；取成熟的米斛果實，首先用1?g/100mL的升汞水溶液進(jìn)行表面消毒30?min，接著用無菌蒸餾水沖洗3～5次，然后切開果實，取出種胚，再將種胚接種在固體MS培養(yǎng)基上，在溫度21±2?℃、光照強(qiáng)度1000～1500?Lx、每天光照12小時的條件下培養(yǎng)20～25天，得到綠色的米斛原球莖；

（2）米斛原球莖的增殖；將綠色的米斛原球莖接種于含有L-鳥氨酸的固體MS培養(yǎng)基上，在溫度21±2?℃、光照強(qiáng)度2000～2500?Lx、每天光照12小時的條件下培養(yǎng)30～35天，得到米斛類原球莖；

（3）米斛類原球莖的適應(yīng)性培養(yǎng)；選擇顏色深綠、直徑為5～8?mm的米斛類原球莖，接種于含有L-鳥氨酸的固體MS培養(yǎng)基上，在溫度21±2?℃、黑暗條件下培養(yǎng)3～5天，得到米斛類原球莖適應(yīng)性培養(yǎng)物；