[發明專利]植物綠色組織特異性表達啟動子pGreen及其應用

有效

• 申請號: 201310476765.8
• 申請日: 2013-10-13
• 公開（公告）號: CN103525818A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 秦毅;方軍;張先文;沈志成
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種在植物綠色組織中驅動基因表達的啟動子及其應用。

背景技術

隨著世界人口的不斷增加，人們對農產品的需求也日益增大，作為生命能源供應的糧食尤為重要，如水稻和玉米等。然而在農業生產中，人類賴以生存的糧食和經濟作物極易受到蟲害的侵襲而減產或使得農產品品質下降甚至產生對人體有毒、有害的物質，造成較大損失。在現代農業中，使用化學殺蟲劑是減少蟲草害的重要方法。但是，化學殺蟲劑的長期、大量使用不僅令生產成本增高，還給生態環境和人畜安全帶來一系列危害。

當今，人們對食物安全性和環保性日益重視，減少甚至杜絕化學農藥的使用是農業生產的新要求。培育轉基因抗蟲作物成為一種有效的途徑。這種新的技術從1996年開始在世界范圍內大規模地應用。目前，世界上應用最為廣泛的抗蟲基因是Bt（Bacillus?thuringiensis）殺蟲基因^[1，2]。2010年全球轉基因作物種植面積達到1.48億hm²,占全球耕地總面積的10%，其中39%是轉入Bt殺蟲基因^[3]。轉基因抗蟲作物的種植可以大幅度減少殺蟲劑的使用量，這不僅大大降低了農民的種植成本，而且對保護人類健康和生態環境都有積極的意義。

隨著對轉Bt基因作物的進一步的研究和廣泛的應用，問題也日益凸顯，主要體現在兩方面，一是害蟲對轉基因作物產生抗性；二是轉基因作物食用安全性問題，尤其是水稻，它作為全球一半以上人口的口糧，公眾對轉基因水稻的食用安全性更是存在著顧慮和質疑。目前用于轉基因抗蟲的Bt殺蟲蛋白中Cry(Crystal?Protein，Cry)蛋白是目前研究最深入、應用最廣泛的Bt殺蟲毒素，但目前已發現多種害蟲對其產生了抗性^[4-7]；而VIP(Vegetative?Insecticidal?Protein，VIP)殺蟲蛋白是一種與ICPs完全不同的新型殺蟲蛋白，對于擴大殺蟲譜、延緩害蟲抗性都具有深遠意義^[8,9]。這些基因資源都已成為構建抗蟲農作物新品種的重要武器。但是這些基因在轉基因植株中多利用組成型的啟動子驅動其表達，這種表達方式由于違背了植物的自然生理活動規律，不僅可能達不到轉基因的目的，甚至對轉基因植物自身的生理活動造成了極大傷害^[10-12]。

針對以上問題，人們做了諸多研究以延緩昆蟲抗性、提高殺蟲活性并最大限度地降低轉基因作物的安全隱患問題，例如堆疊多種殺蟲基因，或使用組織特異性啟動子。啟動子（promoter）是一段位于結構基因5’端上游調控基因表達的DNA序列，有組成型表達、誘導型表達和組織特異型表達3種類型。組織特異型表達的啟動子現在被認為是對目的基因實現高量表達的重要途徑，也是培育高效、安全的轉基因作物的首選^[13]。

綠色組織特異啟動子是高等植物組織特異性啟動子中的一種，驅動外源基因在莖葉等綠色組織中特異表達，它既可以用于以莖葉為主要收獲產物的作物，使蛋白質產物富集于莖葉中，減少宿主植物無謂的物質能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以種子、果實為主要收獲產物的作物，讓抗蟲、抗除草劑等外源基因只在莖葉部分而不在種子果實等器官中表達，解除人們對轉基因作物食品安全性的顧慮^[14]。同時，植物來源的啟動子不會造成基因的逃逸。鑒于此，綠色組織特異性啟動子在植物基因工程研究中具有廣泛的應用前景。

上文中涉及的參考文獻具體如下：

[1]Grochulski?P,L?Masson,S?Borisova,M?Pusztai-Carey,J?L?Schwartz,R?Brousseau?and?M?Cygler.(1995)Bacillus-Thuringiensis?Cry1a(a)Insecticidal?Toxin-Crystal-Structure?and?Channel?Formation.J?Mol?Biol254(3)：447-464（蘇云金芽孢桿菌Cry1a（a）殺蟲毒素晶體結構和孔道形成）；

[2]Vaeck?M,A?Reynaerts,H?Hofie,S?Jansens,MD?Beukeleer,C?Dean,M?Zabeau,MV?Montagu,J?Leemans.(1987)Transgenic?plants?protected?from?insect?attack.Nature328:33-37（轉基因植物能防止害蟲侵害）；