[發明專利]分析方法

有效

• 申請號: 201310475731.7
• 申請日: 2006-02-23
• 公開（公告）號: CN103675259B
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 弗蘭克.弗朗策恩;阿恩.L.法倫;阿恩.K.諾德海
• 申請（專利權）人: 阿克西斯-希爾德公司
• 主分類號: G01N33/532
• 分類號: G01N33/532;G01N33/68;B01L3/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所11105
• 代理人: 張平元

本申請是申請日為2006年2月23日、申請號為200680006015.2、發明名稱為“分析方法”的發明專利申請的分案申請。

本發明涉及分析血液中高半胱氨酸的方法和用于這種方法的分析試劑盒。

高半胱氨酸（HCy）是小的含硫α氨基酸，不用于蛋白質合成，但以低濃度存在于細胞和細胞外液中，例如在成年人血漿中一般約10μM。提高的血漿HCy水平與葉酸或維生素B缺乏以及與心血管疾病相關。因而在分析血漿中的HCy中存在著重要臨床意義。

由Axis-Shield ASA開發了一種這樣的分析系統，可以從AbbottLaboratories商業地獲得。在銷售的前六年中，已經使用這個系統進行了超過2600萬這種HCy分析。Axis-Shield/Abbott HCy分析包括將血漿中的HCy酶轉化成S-腺苷基-高半胱氨酸（SAH）和對SAH的免疫分析檢測。然而Axis-Shield/Abbott HCy分析被設計在臨床實驗室中進行，仍然需要一種HCy分析，其是即時(point-of-care)可進行的形式，例如，在醫師的辦公室中進行，使得患者不必重新訪問來獲知分析的結果。

能夠在即時使用的分析執行設備近來已經由Axis-Shield ASA開發。這是可以商業上獲得的(商標Afinion)，并在例如WO02/090995中進行了描述，在此引用其內容作為參考。在Afinion系統中，樣品（例如，血液、血漿、尿，等等）被置于分析盒中，其含有預先加載了進行分析所需的試劑的幾個孔，并帶有計算機可讀的信息，足以允許設備來確定對于特定的樣品類型和目標被分析物如何進行分析。

我們現在已經開發了即時能夠進行的血漿HCy分析，例如，使用Afinion設備，使用全血，即，不需要從血液樣品分離細胞。

使用全血而不是血漿的能力大大地簡化了醫師所需的樣品操作。

然而使用全血產生了關于血漿HCy分析性能的嚴重難題，因為樣品中的細胞內HCy可能潛在地漏入血漿中。實際上，對于血漿HCy的當前的臨床實驗室分析，醫師被指示從全血中分離血漿，并在30分鐘內冷凍保存血漿樣品，以避免被細胞內HCy污染。細胞內HCy造成的污染必需避免，因為正常/異常血液HCy的當前標準是對于血漿HCy的，還不知道患者之間在細胞內HCy中存在多少差異，以及根據患者的健康狀況這種差異有多少。

然而，我們現在發現，通過延遲細胞裂解直到發生結合，并通過校正血細胞比容，有可能在血漿HCy的酶免疫分析中使用未分離的全血樣品。

因而，從本發明的一個方面考慮，提供了分析采自人類或形成血管的非人動物受試者的血液樣品中血漿高半胱氨酸的方法，所述方法包括：用以下試劑接觸來自所述受試者的全血樣品——液體稀釋劑、還原劑、高半胱氨酸-轉化酶、任選的所述酶的高半胱氨酸轉化反應的抑制劑、細胞裂解劑、能夠與所述高半胱氨酸轉化酶的轉化產物結合的顏色標記的結合劑，和能夠與所述轉化產物競爭與所述結合劑的結合的顆粒；在用所述試劑接觸后，抽吸所述樣品通過具有孔隙的膜，所述孔隙足以使所述結合劑在其未結合狀態時和當與所述轉化產物結合時通過，但不足以容許與所述顆粒結合時的所述結合劑通過；檢測保持在所述膜上的所述結合劑的顏色標記；通過應用取決于所述全血樣品中紅細胞濃度的校正因子，由此確定血漿高半胱氨酸濃度的指標；以及任選的但是優選的，將所述血漿高半胱氨酸濃度表示為可視的或電子的信號；其中與所述試劑接觸在如下情況下是相繼的或同時的：

i）在與所述稀釋劑、酶和還原劑接觸后發生與所述裂解劑的接觸；

ii）當抑制劑存在時，與抑制劑的接觸發生在與所述稀釋劑、酶和還原劑接觸之后，但不晚于與所述裂解劑的接觸；以及

iii）與所述結合劑和所述顆粒的接觸不包括與含有所述結合劑和所述顆粒兩者的液體接觸。

在本發明的方法中，優選的是在細胞裂解開始前（或同時）采取步驟來終止或至少減慢高半胱氨酸轉化酶的HCy轉化。這可以通過改變樣品溫度，例如，來減慢酶反應或使酶變性，或通過稀釋，或通過改變pH值，或通過添加用來抑制反應或使酶變性的試劑（例如，使用洗滌劑如SDS、離液鹽例如NaSCN，或其他已知的變性劑，例如尿素或氯化胍(guanidinium chloride)，或金屬或輔助因子（co-factor）結合劑（其中所述酶反應需要金屬或輔助因子））來實現。當使用變性洗滌劑時，這也可以起到裂解劑的作用。為了方便起見，干擾酶的HCy轉化反應的這種試劑在此是指抑制劑，在本發明方法的優選的實施方式中，抑制劑被包含在一系列使用的試劑中。