[發明專利]一種構巢曲霉ANakr基因及其用途

無效

• 申請號: 201310474487.2
• 申請日: 2013-10-12
• 公開（公告）號: CN103540598A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 陸玲;張元煒;鄭晴晴;浦莉
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/38;C12Q1/02
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明具體涉及基因工程領域，具體涉及一種構巢曲霉ANakr基因及缺失ANakr基因的構巢曲霉唑類藥物敏感株的用途。?

技術背景

在醫學界，隨著高效廣譜抗生素的廣泛應用、抗腫瘤治療的深入開展，器官移植和外科其他介入性治療的不斷應用，侵襲性真菌感染的發生呈現上升趨勢。在免疫體系受抑制或免疫缺陷的病人群體中，患有侵染性曲霉病的人群目前大約有2-10％，其中，全球有約300-400萬人分別患有慢性肺曲霉病和過敏性肺支氣管曲霉病。由于真菌的多樣性、不同真菌侵染途徑的相對獨立性、已有抗真菌藥物的抑真菌效果并不盡如人意。尤為突出的是病原真菌可以通過藥物外排泵的功能性高表達表現為多藥耐藥性。患有免疫缺陷的病人一旦被唑類藥多藥抗性的曲霉菌感染，致死率達到88％。目前治療深度曲霉感染的臨床一線藥物主要是伊曲康唑（ITZ）和伏立康唑（VRC）。然而，已經發現越來越多的臨床分離菌對唑類藥物產生耐藥性。目前認為真菌抗藥性產生的可能機理和途徑包括有：（1）真菌細胞啟動多藥抗性蛋白PDR的表達并行使功能，將唑類藥物(azole)作為底物泵出胞外；(2)真菌細胞會通過改變藥靶——麥角固醇的合成，減少唑類藥物毒害。除了以上兩種傳統的機制以外，現在越來越多的研究表明當真菌處在有唑類藥物的環境中時，藥物通過對細胞膜施壓從而激活真菌細胞逆境響應途徑。?

鈣離子信號系統在真核生物中廣泛存在。在真菌細胞中，具有一套依賴于鈣離子的逆境脅迫應答信號通路。已有的研究成果證實，細胞外藥物等環境能夠導致胞內Ca²⁺濃度的上升，短時間內達到一個峰值，這被認為是調節細胞功能的一個重要引發因子。細胞能夠適應廣泛的環境變化而存活下來主要通過調控不同的基因表達來完成的，隨著對胞外環境的變化的不斷監控，通過上調或下調基因，啟動特殊的代謝反應來抵抗不良的生長環境。?

因此，通過對絲狀真菌逆境響應過程中鈣信號系統的調控作用進行研究，可以更進一步了解菌絲對生長環境的應激反應的分子調控機制，可以更為有效地需找新的藥物靶點，在治療真菌疾病方面具有非常重要的意義。?

發明內容

本發明的目的在于公開了構巢曲霉ANakr基因，以及該基因在構巢曲霉面對胞外低鈣環境響應的影響以及致病機理研究領域的用途，并構建獲得一種構巢曲霉唑類藥物敏感株。?

本發明的構巢曲霉ANakr基因，其序列如SEQ?ID?NO:1所示，它是構巢曲霉高親和性鈣信號系統相關基因。該基因編碼的蛋白序列如SEQ?ID?NO:2所示。?

本發明公開了構巢曲霉ANakr基因的用途，用于構建構巢曲霉ANakr基因缺失菌株，或者用于制備、篩選曲霉病治療藥物。?

本發明所述的ANakr缺失菌株為構巢曲霉唑類藥物敏感株。在所述構巢曲霉ANakr缺失株中ANakr基因不表達。?

本發明所述曲霉病治療藥物為以ANakr基因為治療靶基因，使ANakr基因不表達的藥物、或者以ANakr?基因表達的蛋白為拮抗對象的藥物，或者以ANakr基因和其他基因共同作為靶基因加以沉默的藥物。以ANakr基因為靶點，篩選或制備使該基因不表達的藥物，用于使構巢曲霉對唑類藥物敏感，從而治療曲霉感染。例如，該構巢曲霉治療藥物可以通過RNA干擾或者基因重組的方法使ANakr基因不表達，或者通過制備ANakr蛋白拮抗劑，使ANakr基因表達的蛋白不發揮作用。?

本發明公開了一株構巢曲霉唑類藥物敏感株，為構巢曲霉ANakr基因缺失株，所述唑類藥物敏感株ANakr基因不表達。?

本發明的構巢曲霉唑類藥物敏感株屬于與高親和性鈣信號系統相關基因缺失株。?

所述構巢曲霉ANakr缺失株中，ANakr基因通過同源重組的方法敲除。與野生型構巢曲霉相比，所述缺失株對胞外低鈣環境更加敏感。?

與野生型構巢曲霉相比，所述缺失株菌落生長速率明顯下降。?

本發明還公開了前述構巢曲霉唑類藥物敏感株在研究構巢曲霉鈣信號通路及毒性功能中的應用，或者在制備或篩選曲霉病治療藥物中的應用。?

附圖說明

圖1：構巢曲霉ANakr基因的敲除策略。?

圖2：重組子基因型的PCR結果。?

圖3：構巢曲霉ANakr蛋白表達。?

圖4：構巢曲霉ANakr基因的敲除對菌落生長速率的影響。?

圖5：構巢曲霉ANakr基因的敲除對胞外低鈣環境響應的影響。?