[發明專利]一種人γδT細胞的形態學、純度及免疫表型檢測方法

有效

• 申請號: 201310474485.3
• 申請日: 2012-02-10
• 公開（公告）號: CN103571791A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 馬飛;王宇環;羅曉玲
• 申請（專利權）人: 深圳市合一康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;G01N33/569
• 代理公司: 杭州華鼎知識產權代理事務所(普通合伙) 33217
• 代理人: 魏亮

1.一種人γδT細胞的形態學、純度及免疫表型檢測方法，其特征在于：

首先制備一種人γδT細胞，包括：（1）用培養的結核桿菌制備結核桿菌耐熱性抗原，其具體步驟為：

步驟1：將結核桿菌菌體種子濕重50～100克接種于200ml的蘇通式液體培養基內，于37℃培養箱內靜止培養2周，然后將其分裝到含有10%～30%新生牛血清的250ml的蘇通式液體培養基內，每瓶50ml，分裝成4瓶，再繼續于37℃培養箱內靜止培養4周，收集培養的細菌懸液，經4000轉/分，離心30分鐘以收獲結核桿菌菌體；

步驟2：將收集的菌體經生理鹽水洗滌2次，再用2倍體積的蒸餾水重懸浮菌體，115℃高壓蒸汽處理20分鐘，4000轉/分，離心30分鐘收集上清液，即為Mtb-Hag；

（2）用制備的Mtb-HAg刺激PBMCs，同時加入細胞因子rhIL-2和rhIL-21，其具體步驟為：

無菌條件下用血細胞分離機或50ml注射器采集患者外周靜脈血，經聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞，具體步驟為：1500轉/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56℃滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對倍稀釋沉淀的血細胞，人淋巴細胞分離液與稀釋血液按1:2的比例加入離心管中，2000轉/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉速分別為1600轉/分，1300轉/分，均離心7分鐘，即得到外周血單個核細胞；將上述分離的PBMCs置于含有刺激劑和細胞因子為1～10μg/ml的Mtb-HAg、50～500IU/ml?rhIL-2、5～20ng/ml?rhIL-21和1%～10%自體血漿的RPMI1640、AIM-V或GT-T551培養基內，調細胞密度為（1～2）×10⁶/ml，轉入細胞培養板、培養瓶或培養袋內，于37℃、5%CO2和飽和濕度的培養箱內培養；

（3）細胞培養72小時后進行半量更換培養液并補加等量的rhIL-2，以后根據細胞生長狀態每2～3天進行補加含有等量rhIL-2的培養液，以維持細胞密度為（0.5～2.0）×10⁶/ml；

（4）根據細胞生長狀態，第10～15天收獲細胞；

將細胞培養24小時即可見γδT細胞沉于培養器皿的底部，并趨于集落化，48小時集落開始變大，培養6～10天即可以看到大的集落和不規則的單個核細胞，對培養10天的細胞進行瑞姬氏染色，發現大多數細胞體積增大，呈橢圓形或不規則形，細胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規則，有突起，每個細胞可見1個小核仁，呈深藍色；胞質豐富，染成灰藍色，形態不規則，有偽足，近核處有淡染現象，也有呈不規則形；取培養10天的細胞100μl，加入100μl0.4%臺盼藍染色液，活細胞不染色，死細胞染成藍色，顯微鏡下計數；

分別取第0、7、14、21和28天的細胞，用含5%新生牛血清和0.1%疊氮納的PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×106/ml，每個檢測管內加入50μl細胞懸液，加入熒光標記抗體（抗CD3-FITC、抗TCRγδ-PE）染色，4℃避光孵育30分鐘，用上述PBS洗滌2次，加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式細胞儀進行檢測，數據文件采用WinMDI軟件分析。