[發(fā)明專利]一種促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310473752.5
• 申請(qǐng)日: 2013-10-11
• 公開（公告）號(hào): CN103468664A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李越中;王穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/78
• 分類號(hào): C12N9/78;C12N15/70;C12R1/40
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種促進(jìn)異源蛋白在大腸桿菌中水溶性表達(dá)的方法，尤其涉及一種通過底物添加促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶在大腸桿菌中高效水溶性表達(dá)的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

大腸桿菌作為異源表達(dá)宿主，因其培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，代時(shí)短，遺傳操作體系成熟等特點(diǎn)已成為獲取大量目的蛋白的主要方法。但在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行過量表達(dá)，常常導(dǎo)致蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊、聚集、降解、低活性及以包涵體形式存在等，限制了其相關(guān)的研究和應(yīng)用。

精氨酸脫亞氨基酶（Arginine?deiminase，EC3.5.3.6；ADI）催化L-精氨酸水解為L(zhǎng)-瓜氨酸和氨，與鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、氨甲酰磷酸激酶共同組成精氨酸脫亞氨基酶途徑，廣泛分布于一些以精氨酸為主要能量來源的細(xì)菌、古細(xì)菌及少數(shù)低等真核生物。精氨酸脫亞氨基酶除了可用于生產(chǎn)瓜氨酸外，還被證明其是一種潛在的抗癌藥物，可抑制精氨酸缺陷型腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，（如黑色素瘤、肝癌細(xì)胞）、抗白血病、潛在的抗病毒（HIV）作用等，在醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

目前，研究人員已經(jīng)在大腸桿菌中克隆表達(dá)了來源于支原體(Mycoplasma?arginini)、變形假單胞桿菌（Pseudomonas?plecoglossicida）、鏈球菌（Streptococcus?sanguis）、賈第鞭毛蟲（Giardia?Intestinalis）等微生物的ADI基因。但是，它們?cè)诒磉_(dá)過程中主要以包涵體形式存在，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)瓜氨酸及作為醫(yī)藥制劑。這也是目前ADI研究和應(yīng)用的瓶頸。

在大腸桿菌中主要通過分子伴侶共表達(dá)、分泌表達(dá)、融合表達(dá)及培養(yǎng)條件優(yōu)化等策略來提高重組蛋白的水溶性產(chǎn)量，但是，這些優(yōu)化策略并不能有效地解決每一個(gè)蛋白在表達(dá)純化中所遇到的問題，對(duì)于某些特殊的蛋白，還需要探尋一些新的更加有效的優(yōu)化策略去幫助其進(jìn)行活性表達(dá)。經(jīng)檢索，在分子伴侶共表達(dá)的基礎(chǔ)上，在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中通過添加底物L(fēng)-精氨酸和D-葡萄糖促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)精氨酸脫亞氨基酶研究和應(yīng)用的瓶頸，本發(fā)明要解決的問題是提供一種促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法。

本發(fā)明所述促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法，步驟是：

（1）將來源于惡臭假單胞桿菌（Pseudomonas?putida）的精氨酸脫亞氨基酶（Arginine?deiminase，ADI）基因連接至pET-30a-c(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-ADI，并與pGro7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)中，獲得含雙質(zhì)粒的工程菌；

（2）將步驟（1）所述的含雙質(zhì)粒工程菌接種于LB培養(yǎng)基中，在37±1℃，200±10rpm條件下培養(yǎng)12-18h；

（3）在LB培養(yǎng)基中添加1-10g/L的D-葡萄糖制得LBG培養(yǎng)基，將步驟（2）培養(yǎng)后的菌液按體積比為1%的接種量接種于制得的LBG培養(yǎng)基中，再添加終濃度為0.2-0.8g/L的L-阿拉伯糖，在37±1℃，200±10rpm條件下培養(yǎng)；

（4）當(dāng)步驟（3）所述菌體培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6-0.8時(shí)，向培養(yǎng)液中添加終濃度為1-10g/L的L-精氨酸，和終濃度為0.1mM的IPTG，在16±1℃，180±10rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24-30h；

（5）將步驟（4）培養(yǎng)后的菌液在4℃，8000rpm條件下離心10-15min，棄上清，沉淀用體積比為10%的Tris-NaCl緩沖液重懸，常規(guī)超聲破碎，之后在4℃，12000rpm條件下離心30-35min，分離出可溶性組分與不溶組分，可溶組分即為含有精氨酸脫亞氨基酶的粗酶液。

上述促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法中：步驟（3）所述的D-葡萄糖在LB培養(yǎng)基中添加的終濃度優(yōu)選為5g/L。

上述促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法中：步驟（3）所述的L-阿拉伯糖添加的終濃度優(yōu)選為0.4g/L。

上述促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法中：步驟（4）所述向培養(yǎng)液中添加L-精氨酸的終濃度優(yōu)選為5g/L。

上述用于大腸桿菌（即含雙質(zhì)粒工程菌）培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基組成為：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L?NaCl。