[發明專利]一種毒素蛋白及其純化方法

有效

• 申請號: 201310472474.1
• 申請日: 2013-10-11
• 公開（公告）號: CN103497242A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 王賢純;梁宋平;李建軍;晏益中;段志貴;胡衛軍
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;吳婷

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別地，涉及一種從間斑寇蛛卵粒中提取的毒素蛋白及其純化方法。

背景技術

間斑寇蛛（L.tredecimguttatus）俗稱黑寡婦蜘蛛或黑毒蜘蛛，是一種體型中等的蜘蛛，在分類學上隸屬于節肢動物門，蛛形綱，蜘蛛目，球蛛科，寇蛛屬。間斑寇蛛是目前世界上已知毒性最強的蜘蛛之一，與其他有毒動物不同的是，不僅在其毒腺毒液中存在毒素，而且在身體的其他組織（如腿、腹部組織等）以及卵粒中也存在毒性成分。研究間斑寇蛛毒腺外的毒性成分具有重要的理論和實際意義。

國外相關研究人員對間斑寇蛛的毒腺毒素的研究較為系統和深入，從中分離純化出多種毒素蛋白并對其結構與功能進行了研究，但對該種蜘蛛毒腺外毒素的研究報道較少。相關研究大多在粗提取物的水平上進行，缺乏對其中的活性成分進行完全分離純化和結構與功能分析的研究報道：

1971年Buffkin等人利用分子篩層析將間斑寇蛛卵粒提取物分成了三個主要的峰，并證明第一個大峰成分具有毒性，但由于沒有完全純化，對其中的活性成分缺乏具體的研究。

2001年Akhunov等人也利用分子篩層析將間斑寇蛛卵粒提取物分成了幾個部分，并證明其中三個部分具有毒性，但他們在用離子交換層析對有毒性的部分樣品做進一步分離時，未得到有毒性的純化產物，因此，對間斑寇蛛的卵粒毒素的研究就停留在粗提取物的水平上。

2009年以來，湖南師范大學以王賢純教授為首的研究團隊對間斑寇蛛卵粒的毒性展開了較為系統的研究，不僅對卵粒提取物的理化和生物學性質進行了系統的分析，還利用蛋白質組學的策略對卵粒的蛋白質組進行了鑒定，證明間斑寇蛛卵粒的蛋白質組與毒腺的相似性很小，因而推測其具有與毒腺毒液不同的毒性機制。通過分子篩層析以及離子交換層析步驟純化了一種N-端的部分氨基酸序列為NSIADDRYRWPGYPGAGLIPYIIDS—的蛋白質，并且驗證了其毒性的存在。卵粒中還有很多其它活性成分值得分離純化和深入研究，因此，對間斑寇蛛卵粒毒素的研究具有很重要的意義。

傳統的分離蛋白質的基本策略是先利用分子篩層析或分級沉淀等方法對混合物樣品進行分級分離，然后利用陰或陽離子交換層析進行進一步的純化。由于間斑寇蛛卵粒中的許多蛋白質無論是在分子大小方面，還是在電荷方面，差異都比較小，僅僅根據它們這兩個方面的差異進行分離難以達到純化的目的。鑒于反相高效液相色譜（RP-HPLC）所使用的反相柱是根據物質疏水性的差異對其進行分離，且其分辨率高于一般分子篩層析柱和離子交換柱。但實際工作中，RP-HPLC一般不用于蛋白質的分離，因為蛋白質尤其是分子量較大的蛋白質與分離介質間的疏水相互作用較強，可能引起蛋白質的不可逆吸附或變性。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種毒素蛋白，從間斑寇蛛卵粒中分離純化出來。該毒素蛋白的N-端序列為Glu-Ser-Ile-Gln-Thr-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Asn-Thr-Pro-Asn-Gln-Lys-Phe-Asp-Tyr-Glu-Val-Gly-Lys-Asp-Tyr——，分子量為28690，腹腔注射能引起蜚蠊和小鼠出現一系列中毒癥狀；能抑制神經細胞膜上的河豚毒素不敏感型電壓門控鈉離子通道。

本發明的第二目的在于提供一種上述毒素蛋白的純化方法，具體包括以下步驟：

第一步：卵粒提取物的制備，將間斑寇蛛的卵粒進行勻漿，離心后取上清液作為提取液，沉淀研磨后再次提取，重復2-5次，合并提取液，經冷凍干燥或濃縮后，得到卵粒提取物；

第二步：分子篩層析步驟，將卵粒提取物溶于磷酸緩沖液中，進行分子篩層析分離，通過磷酸緩沖液洗脫，得到洗脫峰，選擇經SDS-PAGE鑒定出的目標峰作為分子篩層析后的目標峰；

第三步：離子交換層析步驟，將分子篩層析后的目標峰在陰離子交換層析柱上進行離子交換層析，得到洗脫峰，取穿過峰作為離子交換層析后的目標峰；

第四步：反相-高效液相層析步驟，采用低疏水性的C4反相柱將離子交換層析的目標峰進行脫鹽和進一步純化，收集經過SDS-PAGE確定的目標峰進行冷凍干燥，即得純化的間斑寇蛛卵粒毒素蛋白。

以上技術方案中優選的，第一步中的勻漿是在緩沖液或水中進行，其中緩沖液的濃度為0.04-1.06mol/L；離心過程具體為：在轉速為8000-10000r/min的條件下離心8-12分鐘。優選所述緩沖液的濃度為0.05mol/L，離心時轉速為10000r/min，離心時間為10分鐘。