[發明專利]具有改善的底物特異性的PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的新變體

無效

• 申請號: 201310472347.1
• 申請日: 2009-06-17
• 公開（公告）號: CN103540572A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: W.韋歇爾;V.莫爾勒;M.欣德勒;R.科克;R.梅斯基斯
• 申請（專利權）人: 拜耳知識產權有限責任公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12Q1/32;G01N27/327;C12R1/01
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 溫宏艷;林森

1.可溶性吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(sPQQGDH)，其特征在于，與不動桿菌屬(Acinetobacter?sp.)?的一種野生型菌株的sPQQGDH相比，其在底物結合區域的范圍內具有4-5個氨基酸的插入，其中基于野生型醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter?calcoaceticus)?LMD?79.41的序列，所述插入位點位于位置Q168與L169之間，并且其中所述插入選自由下列組成的組：

－具有4個氨基酸的插入，其中插入的氨基酸在位置1具有A或G，在位置2具有G、D或L，在位置3具有R或A，和在位置4具有M或V，

－具有5個氨基酸的插入，其中插入的氨基酸在位置1具有A、M、S或V，在位置2具有E、G或S，在位置3具有H、K、R、S或T，在位置4具有F、H、I、L、N、V或Y，和在位置5具有F、H、L、N、Q、T或Y。

2.如權利要求1所述的sPQQGDH，其特征在于，插入位點距離底物結合區域不超過5埃。

3.如權利要求1-2中任一項所述的sPQQGDH，其特征在于，其通過誘變由PT16、KOZ62、KOZ65、PTN69、KG106、PTN26、PT15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25、KGN100系列的菌株產生。

4.如權利要求1至3中任一項所述的sPQQGDH，其具有選自系列SEQ?ID?1-SEQ?ID?18的插入序列。

5.基因，其編碼一種如權利要求1至4中任一項所述的蛋白質。

6.載體，其特征在于，其在插入位點的范圍內具有一個唯一的限制位點，以便可以在該位點插入編碼如權利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH的寡核苷酸序列。

7.如權利要求6所述的載體，其具有序列SEQ?ID?27。

8.用于生產和鑒別如權利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH的方法，其特征在于，在第一步中生產在插入位點的范圍內具有唯一的限制位點的載體，在第二步中將多種不同的寡核苷酸序列插入載體中，在第三步中將這樣獲得的重組載體轉化到宿主細菌中并使細菌增殖，在第四步中篩選細菌產生的sPQQGDH，以便測定sPQQGDH對至少兩種不同的糖的單獨活性以及至少一種糖與至少另一種糖的干擾作用，和在第五步中選擇與未修飾的野生菌株的sPQQGDH相比具有改善的底物特異性的那些sPQQGDH。

9.葡萄糖傳感器，其包含權利要求1-4的sPQQGDH。