[發明專利]基于DNS分析實現柚苷酶催化柚皮苷的快速優化方法

有效

• 申請號: 201310471799.8
• 申請日: 2013-10-11
• 公開（公告）號: CN103555797A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 肖安風;蔡慧農;倪輝;蔣超;黃高凌;朱艷冰;楊遠帆;李利君
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12P19/60
• 分類號: C12P19/60;C12R1/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于DNS分析實現柚苷酶催化柚皮苷的快速優化方法，其特征在于：本方法包括以下步驟：

步驟一、培養基的制備：所述培養基的制備包括斜面培養基的制備及固態培養基的制備，其中：所述斜面培養基的制備，按以下質量體積濃度的組分制備：MgSO₄·7H₂O?1.0?g/L，KH₂PO₄?1.0?g/L，(NH4)₂SO₄?1.5?g/L，KCl?0.5?g/L，KNO₃?1.5?g/L，無水?CaCl₂?0.1?g/L，酵母提取物?2.0?g/L，柚皮苷?2.5?g/L，瓊脂?20?g/L，初始?pH?6.0，1×105?Pa?滅菌20?min；所述固態培養基的制備，按以下重量的組分制備：柚皮粉160g，豆餅粉24g，麩皮1%，KNO_3?1%，固水比為1:1.5，1×10⁵?Pa滅菌20?min；

步驟二、固態發酵：將棘孢曲霉菌種接種于所述斜面培養基上，28°C培養3-4d，使所述斜面培養基上長滿孢子，用無菌生理鹽水洗下孢子，并用無菌生理鹽水調整菌懸液OD值至0.2，將1?mL單孢子菌懸液接入裝有所述固態培養基的250?mL的三角瓶中，每瓶裝樣量為5?g，于28°C下培養7-8?d；

步驟三、粗酶液的制備：以1:20的固液比，用磷酸鹽緩沖液對固態發酵物進行浸泡1?h，攪勻后抽濾并收集濾液，將所述濾液于4°C以12000×g離心10?min，收集上清液即得粗酶液，于0-4°C下保藏備用；

步驟四、酶催化反應：所述酶催化反應為游離柚皮苷的酶催化反應和/或固定化柚皮苷的酶催化反應，其中，所述游離柚皮苷的酶催化反應為：在50?mL的反應體系中，柚皮苷濃度為0.04-0.24g/100?mL，酶用量為4-12?U/mL，以濃度為?0.02?mol/L醋酸-醋酸鈉溶液為緩沖液，反應pH?值為3.0-7.0，置于恒溫振蕩水槽中，反應溫度為30-70oC，振蕩反應4?h，振速為0-160次/min，從加入酶液開始計時，每30?min取反應液一次，沸水滅活后，冷卻至室溫；所述固定化柚皮苷的酶催化反應為：在50?mL的反應體系中，加入1?g濕重的樹脂，柚皮苷濃度為0.08-0.24g/100?mL，酶用量為4-12?U/mL，以濃度為?0.02?mol/L醋酸-醋酸鈉溶液為緩沖液，反應pH?值為3.0-7.0，置于恒溫振蕩水槽中，反應溫度為30-70oC，振蕩反應4?h，振速為0-160次/min，期間從加入酶液開始計時，每隔一段時間取反應液一次，并立即用沸水浴滅活20?min，冷卻至室溫；在其他條件不變的情況下，分別對所述的柚皮苷濃度、酶用量、反應pH值、反應溫度及振速進行單因素試驗，以確定最佳反應條件；

步驟五、DNS法分析還原糖生成量：采用2,?4-二硝基水楊酸即DNS分析所述酶催化反應的還原糖生成量：取0.2?mL所述反應液與0.6?mL?DNS溶液混合，搖勻，100°C水浴15?min，隨即取出用自來水冷卻，再用蒸餾水定容至5?mL，于520?nm波長下測定吸光值，依據標準曲線來計算反應液中還原糖的生成量，其中，繪制標準曲線時，以等摩爾比的鼠李糖和葡萄糖組成的混合溶液為標準溶液，其濃度為0-2?mg/mL。

2.如權利要求1所述的一種基于DNS分析實現柚苷酶催化柚皮苷的快速優化方法，其特征在于：所述步驟四中，所述游離柚皮苷的酶催化反應中，柚皮苷濃度為0.2?g/100?mL，酶用量為8?U/mL，?pH值為5.0，反應溫度為50oC，酶解反應120?min。

3.如權利要求1所述的一種基于DNS分析實現柚苷酶酶解的快速優化方法，其特征在于：

所述步驟四中，所述固定化柚皮苷的酶催化反應中，柚皮苷濃度為0.2?g/100?mL，酶用量為8?U/mL，?pH值為5.0，反應溫度為50oC，振速為80次/min，酶解反應6?h。