[發明專利]一種利用硫酯酶合成Cilengitide的方法

有效

• 申請號: 201310471179.4
• 申請日: 2013-10-11
• 公開（公告）號: CN103525889A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 朱鵬;嚴小軍;方劍;范建忠;黃海龍
• 申請（專利權）人: 寧波大學;寧波博奧生物工程有限公司
• 主分類號: C12P21/04
• 分類號: C12P21/04;C12N9/16
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于綠色化工和酶催化技術領域，具體涉及一種利用硫酯酶（TE）介導的化學酶法催化合成抗腫瘤化合物Cilengitide的方法。

背景技術

Cilengitide是含有RGD（arginine–glycine–aspartate）的五環肽。作為整合素抑制因子，也是癌癥個體化治療研究的一個新類別抗新血管生成的孤兒藥物，這類藥物可以競爭、干擾腫瘤細胞與細胞外基質蛋白（extracellular?matrix?protein，ECM）的相互作用，阻止內源性配體與之結合，從而抑制腫瘤血管的生成和細胞的增殖、侵襲和轉移作用。目前抗腫瘤化合物Cilengitide已經完成了包括膠質瘤（glioblastoma,GBM）在內的多種腫瘤的II-III期臨床試驗。GBM是最具侵略性的惡性腫瘤，而“Cilengitide”是目前唯一處于III期臨床并用于治療該癌癥的整合素拮抗劑。近期結合III期臨床的數據，EMA（European?Medicines?Agency）對Cilengitide做出很高評價，預期不久Cilengitide將通過III期臨床評估，作為治療GBM的特效藥走向市場。但與樂觀的前期臨床研究不同，目前以傳統的環肽化學全合成獲得的Cilengitide價格十分昂貴（約為35000元/g），這將使得其在未來市場化的推廣中障礙重重，進而難以惠及普通大眾。同時化學全合成法也存在高污染、高消耗、多副反應和產率低等不足。因此，如何改變Cilengitide現有環肽合成方式，尋找新的合成途徑，在提高合成效率的同時又降低合成成本是值得深入研究的一個問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種Cilengitide的新型的合成方法，即利用利用硫酯酶（TE）介導的化學酶法催化合成抗腫瘤化合物Cilengitide，在提高了合成效率的同時又降低合成成本。

本發明首先提供硫酯酶的一種新用途，是在合成Cilengitide中的應用；

本發明還提供一種合成Cilengitide的方法，是用硫酯酶來催化底物合成Cilengitide。

上述的底物多肽的序列為：asp-phe-met-val-L-arg-gly；

更具體的，底物為L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly；

為了使底物能更好的和TE酶結合，在C端加上了一個BMT（芐硫醇），

上述的硫酯酶，包含有：

1）氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的酶；

2）與1）中的酶具有同源性，且能用來催化用于合成Cilengitide的底物來合成Cilengitide的酶。

上述2）中的同源性，為具有90%以上同源性；優選為95%以上同源性，最佳為98%或以上的同源性。

上述的硫酯酶，還包括有其它來源的，與氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的酶同源性低于60%，也具有催化底物合成Cilengitide的酶，上述的酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:5-12。

為了增加催化合成的效率，對氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的硫酯酶進行了突變的改造，改造后的硫酯酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:3。

本發明的合成方法與傳統的化學合成法相比，在催化時間上縮短了48倍，由原先的的32h（化學法）縮短為40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了79.3%。因此，該方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。

附圖說明

圖1：本發明硫酯酶催化合成的Cilengtide的HPLC分析圖譜;圖中各個峰分別為：Cilengitide線性底物(Su,30min)，水解產物(Hy,17min),環化產物（Cy,19min）。圖中，A，B，C為標準品的HLPC圖譜；D為沒有TE酶加入的催化反應陰性對照圖譜；E為TE酶加入的催化反應的圖譜;

圖2：Cilengitide標準品的二級圖譜;

圖3：用于TE催化的Cilengitide線性底物的二級圖譜;

圖4：TE酶催化后產物中環肽的二級圖譜；

圖5：TE酶催化后產物中線性底物的二級圖譜。

具體實施方式

對于本發明所涉及的術語的解釋如下：