[發(fā)明專利]小麥矮縮病毒的快速可視化檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310471143.6
• 申請(qǐng)日: 2013-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103667523A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝興安;趙磊;王喬春;吳云鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.小麥矮縮病毒的快速可視化檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟：1)提取步驟：從待檢查標(biāo)本提取DNA；2)擴(kuò)增步驟：使用引物，以步驟1)的DNA為模板，通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行DNA的擴(kuò)增反應(yīng)；3)判斷步驟：檢測(cè)所述擴(kuò)增步驟中是否包含小麥矮縮病毒堿基序列判斷是否存在小麥矮縮病毒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于采用蒸餾水或具有弱堿性的pH緩沖液中將待檢查標(biāo)本以物理方式勻漿，從而提取待檢查標(biāo)本的DNA；其中所用緩沖液選Tris／鹽酸緩沖液、Tris／醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、硼酸緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于擴(kuò)增步驟所用引物為包含下述四種堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組：

WDV-FIP引物，TOGATGOGAOCAAGCAOGTTGTAOGATGOCTTGGAATCTGC;

WDV-BIP引物，AGGAAGTGGAAOGTGAAOCTTGCTAOOCAGTTGTAGOGTTGG；

WDV-F3引物，GTOCAOGATATTCTTGOOGA；

WDV-B3引物，OCAGAOGOCACTGACATC。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于擴(kuò)增步驟的擴(kuò)增反應(yīng)將含有提取步驟中所提取的DNA、引物組、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs，包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP，和緩沖液的反應(yīng)液在等溫條件下靜置15分鐘以上，溫度為50-75℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述溫度為60-65℃，靜置時(shí)間15分鐘-60分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于判斷步驟所用的判斷方法為在判斷步驟開(kāi)始前，將SYBR?Green?I染料加入反應(yīng)管中；經(jīng)擴(kuò)增反應(yīng)后，反應(yīng)液產(chǎn)生綠色的情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液保持橙紅色的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于判斷步驟所用的判斷方法為擴(kuò)增后的反應(yīng)液在UV照射下發(fā)現(xiàn)綠色熒光的情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；未發(fā)現(xiàn)綠色熒光的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于判斷步驟所用的判斷方法為將所擴(kuò)增的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在存在多條梯形條帶情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；只存在單一條帶或者不存在任何條帶的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。

9.一種小麥矮縮病毒的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求2或3所述的引物組、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于為將權(quán)利要求2或3所述的引物組加入Loopamp?DNA擴(kuò)增試劑盒中。