[發明專利]信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310470907.X
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN103513026A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 吳堅;陳春香
• 申請（專利權）人: 吳堅
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本申請是申請號為“201110456124.7”，申請日為“2011年12月30日”，發明名稱為“信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應用”發明專利申請的分案申請

技術領域

本發明涉及免疫快速分析技術領域，尤其涉及一種信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應用。

背景技術

免疫檢測技術是目前醫學、生物學、食品安全等領域最基本也是最常用的檢測技術之一。它廣泛應用于醫學生物學研究、醫學臨床、環境檢測，以及食品和微生物污染的檢測中。免疫檢測技術是基于抗體抗原反應的原理對待測物進行定量定性分析的檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、簡便等優點，是現代生命科學的重要研究手段，在生物分析檢測領域有著廣泛的應用前景。

熒光免疫測定是指將免疫學方法（抗原抗體特異結合）與熒光標記技術（熒光標記物對抗體或者抗原進行標記）結合起來，并通過熒光信號進行檢測的方法。最終目的是通過將抗體與抗原的特異性反應和熒光信號相結合，達到定量檢測的目的。

斑點熒光免疫滲透試驗，在斑點金免疫滲透試驗的基礎上發展起來的，后發展為斑點熒光免疫滲透試驗，而斑點熒光免疫滲透試驗則是用熒光性物質代替了膠體金作為標記物，采用免疫滲透技術、熒光標記物和固相載體相結合的一種檢測方法。

熒光免疫層析是在膠體金免疫層析的基礎上發展起來的，是以NC膜為載體，利用微孔膜的毛細管作用，使滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，如同層析一般。

目前，FITC、羅丹明、量子點、熒光微球等熒光標記物已經廣泛應用于熒光免疫分析技術中。熒光免疫檢測方法具有高特異性、敏感性高、速度快的特點。但是該檢測方法在應對非常微量的物質時，也存在信號低，噪聲干擾大，傳統方法難以檢出等問題。因此，發展新的免疫檢測方法，提高檢測的靈敏度是目前分析檢測領域發展的迫切要求。

發明內容

本發明提供了信號放大型免疫熒光探針的制備方法，將熒光標記物標記在連接有多羧基大分子和聚賴氨酸或者連接有生物素-鏈霉親和素和聚賴氨酸的抗體復合物上，使免疫反應的熒光信號大大放大，提高了熒光免疫檢測的靈敏度。

一種信號放大型免疫熒光探針的制備方法，包括：

（1）在縮合劑的存在下，將對苯二胺和均苯三甲酸加入有機溶劑中，于80-100℃縮合反應3-5h，得到多羧基大分子；

（2）將步驟（1）得到的多羧基大分子加入含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的溶液中進行活化，然后加入抗體，反應0.5-2h；再加入聚賴氨酸，繼續反應0.5-2h，得到表面連接有抗體和聚賴氨酸的多羧基大分子；

（3）用熒光標記物對步驟（2）制得的表面連接有抗體和聚賴氨酸的多羧基大分子進行標記，制得信號放大型免疫熒光探針。

步驟（1）中，所述的縮合劑可以為三苯基亞磷酸鹽（TPP）與吡啶（Py）的混合物；所述的有機溶劑可以為N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）。

所述對苯二胺與均苯三甲酸的摩爾比優選為1:0.8-1:1.2；更優選為1:1。對苯二胺和均苯三甲酸作為反應單體，在縮合劑的存在下能縮合得到多羧基大分子。

優選地，每80-100ml?N-甲基-2-吡咯烷酮中，所述對苯二胺的加入量為10mmol，均苯三甲酸的加入量為10mmol，三苯基亞磷酸鹽的加入量為20-30mmol，吡啶的加入量為5-15ml。

所述的縮合反應過程中對溶液進行攪拌，確保混合物互溶成均相。

所述的縮合反應完成后，對反應產物進行后處理得到多羧基大分子；所述的后處理可以為：將縮合反應3-5h后的反應產物加入含有鹽酸的甲醇溶液中終止反應，分離得到縮合物沉淀，再對縮合物沉淀依次進行重結晶、洗滌和干燥處理。

其中，所述含有鹽酸的甲醇溶液中鹽酸的濃度為10-15mol/L；所述重結晶所用的試劑為N-甲基-2-吡咯烷酮/甲醇混合液；所述洗滌所用的試劑為熱的甲醇；所述的干燥處理為：將縮合物沉淀置于80-120℃烘箱中干燥10-15h。

步驟（2）中，所述含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺（EDAC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的溶液的溶劑可以為磷酸鹽緩沖液（PBS）和二甲基亞砜（DMSO）的混合液。

所述的抗體可以為單抗或多抗。

所述步驟（1）得到的多羧基大分子、抗體和聚賴氨酸的摩爾比優選為1:2:20-1:3:50。

所述的活化時間優選為10-15min。