[發明專利]一種新的循環腫瘤細胞富集技術及試劑盒制備方法

無效

• 申請號: 201310470082.1
• 申請日: 2013-09-28
• 公開（公告）號: CN103725648A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 張萬明;易銀沙;朱海強;李娜;劉彩云;袁炳秋;吳小寧
• 申請（專利權）人: 長沙贏潤生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種新的循環腫瘤細胞富集技術，其特征是，包括以下步驟：

(1)分析所有可能的CD45異構體蛋白序列，設計多個抗原，制備多個抗體；

(2)通過制作多種抗體，從而篩選出能夠識別所有CD45異構體的抗體，將其偶聯到磁珠上，進而從血液中捕獲所有白細胞，其中抗原序列包括有胞外區域的全長，不同外顯子拼接的胞外區域全長，旨在篩選出一種抗體能夠識別他們的共同區段，之所以不單獨采用橙色蛋白區域是因為我們想通過更真實的模擬細胞膜外部分的蛋白構象，直接用多種CD45異構體抗原去篩選我們的抗體，從而得到的抗體能夠在真實水平下直接識別CD45多種異構體；

(3)將血液中分離到的白膜層細胞中的占大多數的CD45+的細胞篩選掉，得到的殘余細胞中，循環腫瘤細胞所占比例大幅度提高，從而能快速的獲得高濃度的循環腫瘤細胞。

2.一種新的循環腫瘤細胞試劑盒制備方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)采集外周血10ml于肝素抗凝管中，加入滲透裂解液中，在室溫下孵育；

其中滲透裂解液成分為：

NH4C1

NaHCO3

EDTA

(2)對滲透裂解液進行離心；

(3)去掉上清，將得到細胞沉淀用無菌的生理鹽水洗一遍，重新離心，搜集細胞沉淀；

(4)按照Sulfo-NHS-LC-Biotin?Biotinylation方法對CD45抗體進行生物素標記；

(5)加入少量無菌PBS于細胞沉淀，輕輕吹打以重懸細胞，同時加入生物素標記的CD45抗體，混合均勻，在室溫下孵育；

(6)在混合物中加入鏈霉親和素偶聯的磁珠，用移液器吹打，使得混合液混合均勻；

(7)用帶有多級探頭的電磁設備搜集磁珠，與磁珠偶聯的鏈霉親和素可以高度特異性地和生物素結合，通過電磁設備搜集到的磁珠上有大量含CD45抗原的白細胞；

(8)將剩余的PBS懸液進行離心，搜集循環腫瘤細胞沉淀；

(9)根據不同的實驗目的，對循環腫瘤細胞做進一步處理，進而制成試劑盒。