[發(fā)明專利]重組豬圓環(huán)病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310470020.0
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103555746A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝振強(qiáng);劉金鳳;鄭文文;吳健敏;金宏麗;覃紹敏;楊佳;陳鳳蓮;段旖;林俊
• 申請（專利權(quán)）人: 長春西諾生物科技有限公司;廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;A61K48/00;A61P31/20;C12N7/04;C12N15/866;A61K39/12;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于豬圓環(huán)病毒2型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組豬圓環(huán)病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒(Porcine?circovirus，PCV)是作為一種豬腎細(xì)胞系PK-15培養(yǎng)污染物而被發(fā)現(xiàn)的，其基因組為共價閉合的單股環(huán)狀DNA分子，基因組全長約1.7kb。PCV是迄今為止人們發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒，病毒粒子表面無囊膜，呈二十面體對稱，粒子直徑在17-20nm之間。根據(jù)PCV的致病性、血清型和基因型特點(diǎn)，將其分為非致病性的PCV1和致病性的PCV2兩種類型。其中，PCV2是引起豬圓環(huán)病毒病（PCVD）的主要病原。PCV2基因組全長為1767bp或1768bp，由11個開放閱讀框（ORF）組成，ORFs之間差異懸殊，并且大部分ORFs都有部分重疊，ORF1和ORF2是PCV2最大的編碼基因，ORF1編碼與病毒基因組復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，而ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap。Cap蛋白是組成病毒衣殼的唯一結(jié)構(gòu)蛋白和主要的抗原表位聚集區(qū)，其氨基末端有序列高度保守的精氨酸富集區(qū)，與病毒DNA的結(jié)合密切相關(guān)，Cap蛋白是公認(rèn)的PVC2的主要保護(hù)性抗原。

眾所周知，疫苗是防控傳染病的最有效手段。2006年，法國梅里亞公司率先研制出經(jīng)歐盟認(rèn)證的首例PCV2全病毒滅活苗；在國內(nèi)，劉長明等成功研制出我國首例PCV2滅活苗（LG株），此外姜平等研制的PCV2疫苗（SH株）也已注冊上市，這兩種疫苗的成功研制和應(yīng)用一定程度上防控了我國PCV2的流行。但是，由于滅活苗具有免疫持續(xù)時間短，免疫注射副作用大，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫等缺點(diǎn)，使得其免疫效果不盡人意。弱毒苗通常能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的免疫力和持久保護(hù)力，但是弱毒苗毒力易反強(qiáng)、致弱毒力評價難，安全性存在隱患，因此國內(nèi)外對PCV2弱毒苗的研究鮮有報(bào)道。DNA疫苗有制備簡單、免疫效果好等諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于缺少高效的基因輸送系統(tǒng)，外源基因在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控及其在體細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移，可能會產(chǎn)生意外的免疫病理反應(yīng)等瓶頸問題難以突破使得大部分DNA疫苗的研究僅局限于實(shí)驗(yàn)室。其它一些重組病毒疫苗、亞單位疫苗對PCV2有一定的保護(hù)效果，但都由于安全性低，免疫效果差等種種原因還處于研發(fā)階段。因此，克服目前PCV2活苗、滅活苗以及基因工程疫苗缺點(diǎn)，尋找新的技術(shù)策略，研發(fā)一種安全、高效非復(fù)制的病毒疫苗是有效免疫防控PCV2的重要科學(xué)前提。

病毒樣粒子（Virus-like?particles，VLPs），是由病毒主要衣殼蛋白或包膜蛋白自主包裝形成的衣殼結(jié)構(gòu)，不含有遺傳物質(zhì)，其形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多肽表位與天然病毒粒子非常相似，因而能夠被宿主抗原提呈細(xì)胞所識別，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性，并且無潛在的毒副作用。目前，國外已有部分VLPs疫苗上市，如乙肝VLPs疫苗、乳頭瘤VLPs疫苗、流感VLPs疫苗等，此外還有戊型肝炎VLPs疫苗等多個品種在臨床研究中，顯示出該類疫苗的巨大潛力。研究證實(shí)，PCV2的Cap蛋白在體外表達(dá)過程中具有自我組裝成病毒樣粒子的特點(diǎn)，近年來，先后有利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在體外制備出Cap蛋白的VLPs，在小鼠和豬體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)中，這些病毒樣粒子都表現(xiàn)出良好的免疫原性。來源于HSV-1VP22轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)域具有強(qiáng)大的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，能將與其偶聯(lián)的外源蛋白帶入細(xì)胞并通過MHC-I類分子介導(dǎo)的抗原提呈，激發(fā)抗原特異性CTL效應(yīng)。VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)域的功能已廣泛應(yīng)用于DNA疫苗及腫瘤疫苗的研究中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種重組豬圓環(huán)病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：Cap-VP22融合基因，該基因由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域核苷酸序列形成。

上述Cap-VP22融合基因，具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列。

上述Cap-VP22融合基因在制備預(yù)防豬圓環(huán)病毒病（PCVD）的疫苗（PCV2疫苗）中的應(yīng)用。

重組豬圓環(huán)病毒2型病毒樣粒子，該病毒樣粒子由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域核苷酸序列形成的Cap-VP22融合基因所編碼。

上述重組豬圓環(huán)病毒2型病毒樣粒子，具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。