[發(fā)明專利]一種含通用堿基寡核苷酸序列及其在DNA雜交分析中的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310469720.8
• 申請(qǐng)日: 2013-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103484458A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖鵬峰;劉必成;錢(qián)曉婷;王柳;陳玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及寡核苷酸領(lǐng)域，具體涉及一種含通用堿基寡核苷酸序列及其在DNA雜交分析中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著人類基因組進(jìn)化的完成，對(duì)人類基因組的研究從測(cè)定DNA序列、解釋所有遺傳信息的研究層面轉(zhuǎn)移到從分子整體水平對(duì)生物學(xué)功能進(jìn)行研究的層面上來(lái)，從而更好利用基因信息進(jìn)行疾病診斷、治療和預(yù)防，達(dá)到認(rèn)識(shí)生命、保護(hù)生命的目的。研究與遺傳表型相關(guān)的DNA序列變異是遺傳學(xué)研究的主題之一，人類基因組序列的變異大多數(shù)是單核苷酸的改變（single?nucleotide?variation,SNV）（包括單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide?polymorphism,SNP）和點(diǎn)突變（Mutation）），而且在不同的人群中，SNV的頻率分布有差異，這些差異可以代表某一種族或人群間的遺傳差異。因此，研究SNV有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)疾病，特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性，以及對(duì)各種藥物的耐受性和對(duì)環(huán)境因子的反應(yīng)。SNV自身的特性決定了它比其他多態(tài)性標(biāo)記更適合于對(duì)復(fù)雜性狀與疾病關(guān)系的遺傳解剖和基于群體的基因識(shí)別等方面的研究。SNV可以被用作遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，定位疾病易感基因，而且其定位的精度比微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)得多，可以直接用于指導(dǎo)易感基因克隆。正像許多研究者認(rèn)為：對(duì)于這些分子標(biāo)記的認(rèn)識(shí)將會(huì)使哮喘、糖尿病、精神分裂癥和癌癥等疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)變得簡(jiǎn)單，同時(shí)SNV也可以被用作疾病的關(guān)聯(lián)分析。目前應(yīng)用于SNV位點(diǎn)的分型方法主要基于四種基本原理：即內(nèi)切酶酶切技術(shù)、等位基因特異性雜交、引物延伸和寡核苷酸連接技術(shù)?；诿盖屑夹g(shù)檢測(cè)方法的前提是待檢測(cè)的SNV位點(diǎn)的兩側(cè)需含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，因此SNV位點(diǎn)不導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的改變的序列則無(wú)法分析。而其余三種技術(shù)在原理上對(duì)分析序列則無(wú)任何限制，并且可以結(jié)合基因芯片技術(shù)進(jìn)行高通量分析。

基因芯片(gene?chip)，也叫DNA芯片、DNA微陣列(DNA?microarray)、寡核苷酸陣列(Oligonucleotide?array)，是在玻片等載體上有序地、高密度地固定不同的靶序列或寡核苷酸片段。目前，基因芯片已廣泛用于發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因、建立疾病診斷指標(biāo)和基礎(chǔ)生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域?；蛐酒粋€(gè)最重要的應(yīng)用是分析和檢測(cè)不同有機(jī)體基因組之間的序列差異，這些差異主要包括突變和單核苷酸多態(tài)性。盡管基因芯片結(jié)合其它技術(shù)衍生出諸多不同的SNV分析技術(shù)：如基于DNA芯片的雜交分型技術(shù)；基于DNA芯片的單堿基延伸-標(biāo)簽分型技術(shù)；基于DNA芯片的寡核苷酸連接分型技術(shù)；基于DNA芯片和多重PCR擴(kuò)增的分型方法等。但這些技術(shù)的核心本質(zhì)實(shí)際上就是以大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù)為前提的，每個(gè)分析序列都需要與探針序列有特異性的雜交，因此特異性探針序列的雜交是這些分析方法準(zhǔn)確性的一個(gè)十分重要的指標(biāo)。

現(xiàn)有基因芯片中特異性探針序列的是由堿基A、G、C、T組成，根據(jù)目標(biāo)對(duì)象的序列、按照特定的Tm值來(lái)設(shè)計(jì)的。探針序列設(shè)計(jì)可以調(diào)變的方式包括序列的長(zhǎng)度和種類，即通過(guò)選定目標(biāo)序列一段或者幾段序列，設(shè)計(jì)出與目標(biāo)序列匹配的一條或者多條探針序列，最后通過(guò)以雜交為本質(zhì)的分析技術(shù)實(shí)施對(duì)樣品的信號(hào)檢測(cè)，得出目標(biāo)樣品的遺傳信息(基因序列及基因表達(dá)的信息)。很明顯，這種通過(guò)選定某個(gè)特定片段作為雜交區(qū)域，只能依靠改變堿基數(shù)目這一個(gè)條件來(lái)確定Tm值的探針序列設(shè)計(jì)方式無(wú)疑受到了很大的限制。一方面，對(duì)于數(shù)目較多的DNA芯片而言，要將所有序列盡可能設(shè)計(jì)成相近的Tm值本身就是一個(gè)困難；另一方面，即使DNA芯片上所有序列設(shè)計(jì)的Tm值相近，但能否有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配也存在問(wèn)題，因?yàn)閱螇A基錯(cuò)配的區(qū)分往往需要更苛刻的條件才能實(shí)現(xiàn)，如在優(yōu)化雜交溫度降低非特異性序列雜交的前提下，還需要通過(guò)強(qiáng)化清洗的強(qiáng)度（如在特定溫度下進(jìn)行洗滌）、或者采用電場(chǎng)電泳等手段，來(lái)清除非特異性雜交的探針序列。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種含通用堿基寡核苷酸序列，通過(guò)在寡核苷酸序列中引入通用堿基，利用其能夠和四個(gè)基本堿基形成弱氫鍵配對(duì)的特點(diǎn)，有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配序列，解決了現(xiàn)有技術(shù)中不能有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配的問(wèn)題。本發(fā)明還提供了該含通用堿基寡核苷酸序列在DNA雜交分析中的應(yīng)用。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：