[發(fā)明專利]抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA、慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310469472.7
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103497953A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李湘萍;石德順;林浪
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水牛花斑抑制因子同源物1（SUV39H1）基因，尤其是一種抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA、慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

水牛是我國南方主要大家畜之一，具有耐高溫高濕、抗病力強、耐粗飼等生物學(xué)特性，非常適合我國南方農(nóng)村飼養(yǎng)。水牛奶的品質(zhì)好、營養(yǎng)價值高，其干物質(zhì)的含量、乳脂率和總蛋白的含量均為普通牛奶的2倍，特別是乳酪蛋白的含量（4.14%），是黑白花奶牛的16倍（0.26%），是制造高檔奶酪的優(yōu)質(zhì)原料。因此，開發(fā)利用水牛畜種資源，將現(xiàn)有役用水牛轉(zhuǎn)化為乳用或乳肉兼用的商品水牛，是水牛畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢。然而，水牛的自然繁殖率很低、種群生產(chǎn)性能低下，急需發(fā)展和完善一批與家畜遺傳改良密切相關(guān)的農(nóng)業(yè)高技術(shù)來提高水牛繁殖力。利用胚胎生物技術(shù)和克隆技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)，是培育高繁殖力和高產(chǎn)奶量水牛新品種的一條有效技術(shù)措施。

轉(zhuǎn)基因動物制備過程中，外源基因的表達(dá)水平受到很多因素的影響，其中表觀遺傳修飾是影響外源基因表達(dá)效率的一個重要因素。組蛋白甲基化是組蛋白修飾方式之一，在廣泛的表觀修飾中，組蛋白甲基化對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能都具有很重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA、慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA，該shRNA為shSUV39H1-259或shSUV39H1-597，它們都包含19nt的siRNA正義鏈，9nt的loop環(huán)，19nt的siRNA反義鏈和終止信號；loop環(huán)的堿基序列為TTCAAGAGA；終止信號的堿基序列為TTTTTTT；shSUV39H1-259的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.2的堿基序列；shSUV39H1-597的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.4的堿基序列。

上述抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA的慢病毒表達(dá)載體，該載體是：

pSicoR-GFP-shSUV39H1-259或pSicoR-GFP-shSUV39H1-597。

上述抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，慢病毒表達(dá)載體由合成的shSUV39H1-259或shSUV39H1-597分別克隆入慢病毒表達(dá)載體pSicoR-GFP中而得。

上述抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA在抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)方面的應(yīng)用。

上述抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA的慢病毒表達(dá)載體在抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)方面的應(yīng)用。

上述抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA在調(diào)控轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因的表達(dá)效率方面的應(yīng)用。

上述抑制水牛SUV39H1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體在調(diào)控轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因的表達(dá)效率方面的應(yīng)用。

SUV39H1蛋白是哺乳動物中首個被確認(rèn)的組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶，是一種專一作用于組蛋白H3第9位賴氨酸，它特異地結(jié)合到組蛋白H3K9me1/2位點，表觀遺傳修飾中，SUV39H1基因所催化的組蛋白H3第9位賴氨酸殘基位點的二甲基化和三甲基化（H3K9me2/3）作用尤為突出并主要催化H3K9的三甲基化，促進異染色質(zhì)的形成和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，直接影響外源基因表達(dá)效率。除參與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)外，SUV39H1基因還與DNA甲基化、組蛋白乙酰化等表觀修飾有關(guān)。因此，有必要為進一步了解SUV39H1在調(diào)控外源基因表達(dá)機制方面奠定基礎(chǔ)，并為研究其在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

為此，發(fā)明人利用分子和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，首先克隆得到水牛花斑抑制因子同源物1（SUV39H1）編碼區(qū)，構(gòu)建了水牛SUV39H1基因融合蛋白表達(dá)載體，設(shè)計合成了水牛SUV39H1基因shRNA片段并構(gòu)建其慢病毒表達(dá)載體。然后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將水牛SUV39H1基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒和其shRNA慢病毒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，收集細(xì)胞檢測水牛SUV39H1基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)，快速篩選獲得高效抑制水牛SUV39H1基因的shRNA干擾序列，并嘗試其在調(diào)控轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因的表達(dá)效率方面的應(yīng)用。本發(fā)明研究工作包括以下基本步驟：