[發明專利]來源于大豆的根特異性啟動子GmPRP2p-852及其應用

在審

• 申請號: 201310466928.4
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN104560986A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 陳莉;韓天富;吳存祥;侯文勝;蔣炳軍;孫石
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12N15/11;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種來源于大豆的根特異性啟動子GmPRP2p-852及其應用。

背景技術

啟動子是基因的組成部分，控制基因表達的起始和表達程度。在轉基因育種中，外源基因在植物體中的精確調控主要是通過合適的啟動子實現的。目前，在基因工程中廣泛使用的是組成型啟動子，但是由于組成型啟動子驅使目的基因在植物組織中的表達是恒定和持續的，不受時空和外界因素的限制，會過度消耗細胞內的物質和能量，產生大量異源蛋白質或代謝產物，破壞了植物原有的生理代謝平衡，導致植物生長異常甚至死亡。與組成型啟動子相比，根特異性啟動子它所驅動的外源基因在受體植物根中表達，克服了組成型啟動子由于持續、高效的啟動外源基因非特異性表達而造成的細胞物質的過度消耗。隨著轉基因植物安全標準的提高，包括所有商業化轉基因農作物在內，要求必須對所用啟動子的表達活性、潛在重組能力、對周邊環境以及安全性影響進行詳細的研究。

大豆是一種重要的糧油飼兼用作物，在我國大豆產區大多處于干旱、鹽堿及高寒等區域，應用的大豆品種耐逆性不強，嚴重的旱澇病蟲害等非生物和生物逆境脅迫顯著影響大豆產量。目前在轉基因大豆中使用的都是CaMV35S啟動子，根特異啟動子應用到大豆轉基因中，為大豆轉基因研究提供更加豐富的啟動子元件，同時也為培育耐旱、耐鹽、耐冷等轉基因大豆新品種提供一種手段。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有啟動子功能的DNA分子。

本發明所提供的具有啟動子功能的DNA分子，來源于豆科大豆屬栽培大豆（Glycine?max（L.）Merr.）Williams82，是下述a）-c）中任一DNA片段：

a）至少含有序列表中序列2的第211-1062位核苷酸序列，并且從序列2的第211位開始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5′端延長，得到長度為852至1062bp的任意一個DNA片段；

b）與a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；

c）在嚴格條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。

上述嚴格條件可為在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

在本發明中，所述具有啟動子功能的DNA分子為序列表中序列2的第211-1062位核苷酸所示的DNA分子，命名為GmPRP2p-852。

其中，序列表中序列2由1062個核苷酸組成，為序列1的第1-1062位。

含有所述DNA分子（啟動子）的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。

在本發明中，所述重組載體為在pC13P1載體的多克隆位點（如SacⅠ和XbaⅠ）插入含有所述DNA分子的DNA片段后得到的重組質粒。

進一步，所述重組載體按照如下方法獲得：將所述DNA分子與pEASY-T1載體相連，得到中間載體；用限制性內切酶SacⅠ和XbaⅠ雙酶切所述中間載體，將還有所述DNA分子的酶切片段與同樣經過限制性內切酶SacⅠ和XbaⅠ雙酶切的所述pC13P1載體的骨架片段相連，得到所述重組載體。

所述pC13P1載體是以pCAMBIA1301載體為基礎改造得到的環形載體，所述pC13P1載體上不含有任何啟動子的序列，用來滿足研究啟動子功能的需要。

具體而言，所述pC13P1載體的序列如序列表中序列3所示。

所述表達盒可以由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉錄終止序列連接。

在本發明的一個實施例中，所述目的基因具體為GUS基因（來源于所述pC13P1載體）；所述轉錄終止序列具體為NOS轉錄終止子（來源于所述pC13P1載體）。

所述DNA分子在植物中啟動目的基因表達中的應用也屬于本發明的保護范圍。

在所述應用中，所述表達為根特異性表達。

進一步，所述根特異性表達可為根中高表達，具體為根中的表達量顯著高于其他組織（如葉柄、葉片主脈、花、果莢外殼）。在其他組織中只存在微量的表達。

在所述應用中，所述目的基因可為GUS基因。所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥或大豆。