[發明專利]一種來源于虎眼萬年青的苯丙氨酸解氨酶，其核苷酸序列及應用

無效

• 申請號: 201310466763.0
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN104560928A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 孔建強;王志標;陳茜;王偉;程克棣
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥物研究所
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/81;C12N15/82;C12N15/70;C12N15/74;C12N1/19;C12N1/21;C12N1/15;C12N5/10;C12P7/40;C12P7/42
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 何文彬

技術領域

本發明涉及一種苯丙氨酸解氨酶，其編碼基因及其在催化底物L-苯丙氨酸為反式肉桂酸，以及催化底物L-酪氨酸為對香豆酸反應中的應用，屬于基因工程領域。特別涉及虎眼萬年青苯丙氨酸解氨酶，其編碼基因及其在催化底物L-苯丙氨酸為反式肉桂酸，以及催化底物L-酪氨酸為對香豆酸反應中的應用。

發明背景

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine?ammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5）作為苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，在自然界中通過參與苯丙氨酸和酪氨酸等氨基酸的降解，形成反式肉桂酸和對香豆酸等代謝中間產物，這些中間產物在香豆酰輔酶A連接酶的作用下轉化為硫酯化合物，再通過多條途徑進一步轉化為黃酮和異黃酮等次生代謝產物。其中黃酮類化合物在自然界中種類眾多，已有超過9000多種被發現，它們不僅賦予了花朵美麗的顏色，也同人類健康息息相關。黃酮類化合物具有多種藥理活性：抗氧化消除體內的氧負離子；降低血小板、抑制體內低密度脂蛋白氧化保護心血管；抑制纖維母細胞生長從而發揮抗炎作用；此外還具有雌激素樣作用從而在抗腫瘤，抗骨質疏松等中發揮療效。一些黃酮類藥物已經上市，如黃芩苷，銀杏黃素和葛根素等。因此，克隆PAL基因并對其進行功能鑒定對于通過合成生物學技術規模化制備黃酮類天然產物，減少由于化學合成以及植物提取黃酮類天然產物等傳統方法對環境和物種造成的壓力，從而促進社會可持續發展具有很重要的意義。

迄今為止，已在多種植物，真菌，細菌等生物中發現并克隆得到苯丙氨酸解氨酶基因，而尚沒有從虎眼萬年青（Ornithogalum?saundersiae）中分離得到該蛋白的報道。本發明根據轉錄組測序結果，通過提取虎眼萬年青RNA，利用RT-PCR，從虎眼萬年青無菌鱗莖中克隆得到一個完整的PAL基因，命名為OsaPAL2基因，并對其進行了功能鑒定，這是首次從虎眼萬年青植物中克隆得到這個基因。

發明內容

本發明的首要目的是提供一種苯丙氨酸解氨酶。

本發明的第二目的是提供編碼該酶的核苷酸序列。

本發明的第三目的是提供含有該核苷酸序列的表達載體。

本發明的第四目的是提供含有該表達載體的宿主細胞。

本發明的第五目的是提供苯丙氨酸解氨酶的應用。

為了實現本發明之目的，采用的技術方案為：

本發明提供一種來源于虎眼萬年青的苯丙氨酸解氨酶，其特征在于：

a)SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列；

b)SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列經替換，缺失或添加1-71個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發明還提供一種編碼所述苯丙氨酸解氨酶的基因序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明還提供一種含有所述核苷酸序列的表達載體。

本發明還提供一種所述表達載體的宿主細胞。其中所選宿主細胞優選大腸桿菌，釀酒酵母，畢赤酵母，鏈霉菌和植物細胞，更優選的宿主細胞選自大腸桿菌。

本發明還提供了苯丙氨酸解氨酶或含有苯丙氨酸解氨酶的細胞在催化底物L-苯丙氨酸為反式肉桂酸以及L-酪氨酸為對香豆酸反應中的應用。其中苯丙氨酸解氨酶的底物包括L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，形成的產物分別為反式肉桂酸和對香豆酸。

附圖說明

圖1：OsaPAL2基因的PCR分析結果，其中M是DNA分子量標準；1是OsaPAL2基因PCR結果。

圖2：重組質粒pET28a-OsaPAL2示意圖。

圖3：OsaPAL2重組蛋白SDS-PAGE分析銀染結果，其中M為蛋白分子量標準；1為OsaPAL2；2為空載體對照。

圖4：OsaPAL2重組蛋白免疫印跡結果，其中CK為對照；1，2為OsaPAL2。

圖5：咪唑洗脫純化后OsaPAL2蛋白SDS-PAGE分析銀染結果，其中1為目的蛋白；M為蛋白分子量標準。

圖6：OsaPAL2重組酶催化L-苯丙氨酸HPLC-UV檢測結果，其中1為底物L-苯丙氨酸標準品；2為反式肉桂酸標準品；3為對照組（空載體）；4為實驗組。

圖7：OsaPAL2重組酶催化L-酪氨酸HPLC-UV檢測結果，其中1為香豆酸標準品；2為底物L-酪氨酸；3為對照組（空載體）；4為實驗組。

圖8：OsaPAL2催化L-苯丙氨酸產物及反式肉桂酸標準品HPLC-MS結果，其中1為反式肉桂酸標準品；2為PAL2-L-Phe-p。