[發明專利]一種純化多肽類PDGF受體抑制劑的方法

無效

• 申請號: 201310466595.5
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN104558125A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 張明義;黃嵐;周華
• 申請（專利權）人: 無錫麥濤嵐華生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及用于腫瘤、器官纖維化等疾病治療的PDGF受體抑制劑的純化，該抑制劑由47個氨基酸組成，采用固相合成工藝，本發明涉及的是通過固相合成獲的粗肽粗提、精制的純化方法。

背景技術

腫瘤是危害人類健康的重大疾病，每年有數以百萬計的患者感染，造成大量患者死亡，以肝癌為例，作為高度惡性化的腫瘤之一，中國每年死于肝癌及其并發癥的患者高達47萬例，用于肝癌治療的費用達到200億元人民幣，嚴重占用了醫療資源和經費，對于進行有效的治療成為急需解決的重大問題。

已有的研究成果顯示，血小板衍生生長因子（platelet?derived?growth?factor，簡稱PDGF）——血小板衍生生長因子受體（platelet?derived?growth?factor?receptor，簡稱PDGFR）信號傳導通路（以下簡稱PDGF-PDGFR信號傳導通路）的活躍表達與肝癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等實體瘤的發生和發展具有一定的相關性，提示阻斷PDGF-PDGFR信號傳導通路將有助于腫瘤的治療，專利號ZL?2008?1?0200937.8的專利中詳細描述了該信號傳導通路的技術內容并對由用于腫瘤和纖維化疾病治療的由47個氨基酸組成的多肽PDGFR抑制劑（以下簡稱P47）申請了結構、序列和用途專利；專利申請號201310458634.7的專利中詳細描述了采用固相合成的方法合成P47粗肽的方法。

采用固相合成的方法進行多肽藥物的合成，在合成結束后將使用適宜的切割液對多肽-樹脂進行切割以使粗肽與樹脂分離并去除粗肽側鏈上的保護基，經過洗滌、干燥后獲得目的多肽含量在20%-70%的粗肽，可用于臨床的藥用多肽，其含量通常應達到95%以上，為了提高多肽的純度，有效去除空心肽、催化劑等雜質，本領域最常用的辦法是使用適宜的溶劑例如醋酸水溶液、醋酸乙腈水溶液等進行溶解后，利用反相HPLC技術進行純化。反相HPLC具有很高的分辨率，但是存在反復使用易使壓強增高、鹽成分對填料損傷較大等問題，因此需要引入新的方法對多肽進行預處理后再利用反相HPLC進行精制。

離子交換是一種常用的分離技術，隨著材料生產企業的不斷努力，越來越多的介質被開發并在生產實踐中得到廣泛的應用，離子交換樹脂具有價格低廉、工作范圍廣、對有機溶劑耐受、可耐堿溶液在位清洗等優勢，因此在生物技術藥物尤其是重組藥物的分離純化中成為常規的純化手段，但是在化學合成多肽藥物的純化中的應用較少。

P47由47個氨基酸組成，具有一定的蛋白特性，在固相合成并切割后含有三氟乙酸等無機鹽和有機溶劑，直接采用反相HPLC會對介質造成一定的損傷，而且雜質的存在會影響反相柱的載量，因此有必要對其進行前處理，經過粗提后將P47的含量提高到80%左右并最大限度的去除無機鹽及有機溶劑，將有利于后續的精制。

發明內容

本發明提供了一種純化P47的方法，該方法通過使用陰離子交換柱對P47進行粗提并轉換鹽后再采用反相HPLC進行精制，最終獲得純度超過95%的精制P47，可以用于臨床。本發明所提供的方法簡單易行并具有高達25%的收率，便于規模化生產，符合產業要求。

本發明提供了一種純化P47的方法，該方法適用于采用固相合成方法合成并完成切割的粗肽的純化，本方法的起始物料為采用固相合成方法獲得的多肽-樹脂，經過適宜的切割劑將多肽從樹脂上切割并切除側鏈保護基的粗肽，該粗肽經過乙醚洗滌并充分干燥，后續的純化包括如下步驟。

步驟1：采用陰離子交換樹脂進行粗提。溶解P47粗肽，使用平衡液A平衡離子交換樹脂，上樣進行吸附，使用平衡液B平衡并去除雜質，使用洗脫液洗脫獲得粗制P47溶液。

步驟2：采用反相HPLC進行精制。以十八烷基硅膠為固定相，使用平衡液C平衡，將粗制P47溶液上樣，以一定濃度比的醋酸乙腈水溶液作為流動相進行洗脫，收集主峰既得精制P47溶液。

步驟3：:將精制P47溶液去除乙腈等有機溶劑，置于冷凍干燥機進行真空冷凍干燥得到干燥的P47純品。

作為優選：本方法的起始物料經由固相合成方法合成，如果采用液相合成和/或生物合成的方法獲得的樣品也可部分或全部的采用本專利所描述的方法進行分離純化。此方法中的部分或全部技術內容對于本專業的技術人員而言是可以簡單推理獲得并借鑒使用。

作為優選：步驟1中用于溶解P47的液體為水溶液，亦可采用含有有機溶劑的水溶液，使用有機溶劑可以增加P47的溶解度，可采用的有機溶劑包括但不限于乙腈、甲醇、乙醇等，其中優選的有機溶劑為乙腈。